基因工程与敲除鼠

基因工程与基因敲除

(geneticrecombination

andgeneticengineering)基因重组是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。基因克隆

将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程目的：①分离获得某一目的基因或DNA②获得目的基因的表达产物（蛋白质）基因工程实现基因重组和基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组DNA技术或基因工程。重组DNA技术的基本流程目的基因的获取；克隆载体的选择和处理外源基因与载体的连接重组DNA导入受体菌重组体的筛选

本节主要内容

一、重要的工具酶二、基因克隆常用的载体

三、重组DNA基本原理四、重组技术在医学和制药工业中的应用

五、基因工程制备敲除鼠文献解析一、重要的工具酶工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶逆转录酶

DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶（一）限制性核酸内切酶(RE)

是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。

根据限制酶的作用特性，一般分为三类：

——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。

限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种缺口：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平端或钝端

回文序列是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;

粘性末端是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的碱基序列相互具有互补性。⑴产生5'-粘性末端

⑵产生3'-粘性末端⑶产生平头末端/钝端其它特殊性质的Ⅱ型限制酶同裂酶（异源同工酶）同尾酶可变酶同裂酶

又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。同裂酶——同识同切同裂酶——同识异切同尾酶

同尾酶

识别DNA分子中不同核苷酸序列，作用后产生相同的粘性末端。可变酶可变酶

识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。如，BstpⅠ，其识别顺序为GGTNACC。（二）DNA聚合酶（DNApolymerase)

（最常用的DNA聚合酶有以下4种）

1.DNA聚合酶Ⅰ2.DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段

3.TaqDNA聚合酶

4.T4噬菌体DNA聚合酶1.DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ）

E.Coli

DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：

5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性

5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性

3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性E.coliDNApol.Ⅰ催化切口平移DNApolⅠ应用⑴催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；⑵第二条cDNA链的合成；⑶对DNA3’突出末端进行标记；⑷DNA序列分析。2.Klenow片段（DNApol.大片断）Klenow片段用途⑴补齐双链DNA的

3ˊ末端；⑵用标记碱基补齐3ˊ末端；

⑶在cDNA克隆中，用于第二股链的合成；⑷

DNA序列分析。3.TaqDNApol（耐热DNA聚合酶）

作用特点1）TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围

70

75℃，2）95℃以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。（三）逆转录酶⑴以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链⑵水解RNA：DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板，催化合成cDNA双链。

特点一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：

逆转录酶的应用：⑴将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；⑵补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制备杂交探针等。（四）DNA连接酶(DNAligase)

DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。

DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA连接酶

5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修补带有缺口的双链DNA分子T4DNA连接酶（五）碱性磷酸酶

碱性磷酸酶(BAP)能够催化水解去除DNA或RNA5'-端的磷酸基团。用途⒈制备载体时，去除载体分子5ˊ－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。⒉用32P标记5'-端前，去除5'-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端进行标记。（六）末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT)

作用将dNTP加到DNA的3’-OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。应用①探针标记

P32-α.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32

②在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接重要的工具酶工具酶

活性限制性核酸内切酶

识别特异序列，切割DNADNA聚合酶

以DNA为模板合成DNA逆转录酶

以RNA为模板合成DNAT4DNA连接酶

催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基形成磷酸二酯键碱性磷酸酶

切除末端磷酸末端转移酶

催化3'-端合成同聚体尾二、基因克隆常用的载体载体(vector)

是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为DNA。

主要内容载体必须具备的基本条件载体的种类常用的载体（一）载体必须具备的基本条件⒈有自身的复制子，能独立复制⒉具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)⒊具有遗传表型或筛选标记⒋有足够的容量以容纳外源DNA片段。⒌表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。（二）载体的种类1.克隆载体

用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点共性：⑴能够在受体细胞复制；⑵带有药物抗性基因，便于筛选；⑶可导入受体细胞。2.表达载体除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件——转录和翻译所必须的DNA顺序。（三）常用的载体

1.质粒(plasmid)：

是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。

作为克隆载体的质粒应具备以下特点：

①

分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内

②

具有1个以上的遗传标志，便于筛选

③

具有多克隆位点

常用的质粒：pBR322质粒、pUC系列等

pBR322质粒①4363bp②含一个复制点(ori)含一个抗氨卞青霉素标记(ampR)④一个抗四环素标记(tetR)⑤ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入

pUC系列质粒

由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampr和与M13噬菌体相同的多克隆位点（MCS）（3）有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断,编码半乳糖苷酶2.λ噬菌体

组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含65个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。

λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长

溶菌性生长噬菌体感染细菌后，2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。

溶源性生长

噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。

λ噬菌体两种生长途径（示意图）

三、重组DNA基本原理

（DNA重组基本程序包括下列过程）

分—获取目的基因和载体接—目的基因与载体的连接转—重组DNA导入宿主细胞筛—重组DNA的筛选与鉴定(一)目的基因的获取（分）目的基因是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。

目的基因来源

1.制备基因组DNA2.制备cDNA3.聚合酶链式反应

4.人工合成基因1.基因组DNA(基因文库)限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装2.制备cDNA

分离目的基因的mRNA逆转录生成cDNA单链水解去除mRNA，合成cDNA双链水解回折处单链得到平端双链cDNA导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库3.聚合酶链反应(PCR)

在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等条件下，体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增目的基因。

4.化学合成法较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物测序引物定点突变核酸杂交探针(二)目的基因与载体的连接（接）

（主要有以下4种连接方式）

1.粘性末端连接

2.平头末端连接

3.人工接头法

4.同源多聚尾连接法

1.粘性末端连接

将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。2.

平头末端连接

在T4DNA连接酶的作用下将平头末端的目的基因与载体DNA连接起来。3.人工接头法合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割，产生粘性末端→连接，构建重组DNA。4同源多聚尾连接法

转化

以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染

以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导

以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。

感受态细胞

用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力，这种细胞称感受态细胞。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。(三)重组DNA导入宿主细胞（转）

（四）重组DNA的筛选与鉴定（筛）（筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法）

1）平板筛选

2）限制酶切图谱筛选

3）PCR筛选重组体