重组DNA技术的基本工具第2课时高二下学期生物人教版选择性必修3

第1节重组DNA技术的基本工具（第二课时）第三章

基因工程复习——限制酶限制酶来源特点原核生物特异性只识别特定的核苷酸序列只断开特定部位的磷酸二酯键一般由6个核苷酸组成（回文序列—中心对称、反向平行）切割末端类型黏性末端和平末端复习——限制酶②能根据切出的片段说出限制酶的识别序列和位点···G···CTGCAGACGTC①找出限制酶的识别序列和切割部位/写出黏性末端EcoRⅠ：—GAATTC—…TCCTAGAATTCTCGGTATGAAT……AGGATCTTAAGAGCCATACTTA…TaqⅠ：—TCGA—复习——限制酶③限制酶作用后产生的黏性末端、断裂的磷酸二酯键数等问题限制酶作用一次：断开_____个磷酸二酯键；产生_____个游离的磷酸基团；产生____个黏性末端；消耗____分子水；2222复习——限制酶④切割出的片段数量问题（如图最多产生多少不同长度的片段？）Ⅰ编号Ⅱ从最小片段算起abc复习——DNA连接酶DNA连接酶E.coliDNA连接酶（形成磷酸二酯键）T4DNA连接酶只缝合黏性末端缝合黏性末端和平末端（效率低）能碱基互补配对DNA聚合酶vs以一条链为模板，将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键复习——质粒种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。条件①具有一个至多个酶切位点【供外源DNA片段（基因）插入其中】②能在细胞中进行自我复制或者整合到受体DNA上【使目的基因同步复制并能在受体细胞中稳定存在】③具有特殊的标记基因【便于重组DNA分子的筛选】④对受体细胞无毒害作用【不影响受体细胞的正常生命活动】DNA的粗提取与鉴别实验原理8DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色初步分离DNA和蛋白质溶解DNA鉴定DNA

1.材料：新鲜洋葱（也可以选择香焦、菠菜、菜花和猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。

2.用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。实验用具DNA的粗提取与鉴别取材、研磨过滤或离心取上清液预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鉴定DNA的粗提取与鉴别称取

，切碎，放入研钵，倒入

，充分研磨。洋葱研磨液选取DNA含量相对较高的生物组织能不能选择哺乳动物成熟的红细胞？取材、研磨过滤或离心取上清液预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鉴定DNA的粗提取与鉴别称取

，切碎，放入研钵，倒入

，充分研磨。洋葱研磨液选取DNA含量相对较高的生物组织不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为它没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA作用：溶解并提取DNA研磨的目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中SDS：使蛋白质变性与DNA分离;EDTA：是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后

DNA酶降解DNA;Tris：提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。NaCl：溶解DNA研磨液可以用洗涤剂和食盐取材、研磨过滤或离心取上清液预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鉴定DNA的粗提取与鉴别称取

，切碎，放入研钵，倒入

，充分研磨。洋葱研磨液在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置几分钟后取

；或将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min下离心5min，取

。上清液上清液不可以用滤纸代替，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。取材、研磨过滤或离心取上清液预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鉴定DNA的粗提取与鉴别称取

，切碎，放入研钵，倒入

，充分研磨。洋葱研磨液在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置几分钟后取

；或将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min下离心5min，取

。上清液上清液上清液中除DNA外，可能含有哪些杂质？RNA以及蛋白质、脂质、糖类等低温放置几分钟的作用？不可以用滤纸代替，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。①抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出DNA的粗提取与鉴别取材、研磨过滤或离心取上清液预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鉴定称取

，切碎，放入研钵，倒入

，充分研磨。洋葱研磨液在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置几分钟后取

；或将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min下离心5min，取

。上清液上清液在上清液中加入体积相等的、

溶液（体积分数95%）,静置2~3min，溶液中出现的

就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，用滤纸吸取上面的水分预冷的酒精白色丝状物防止丝状DNA破碎，可以完整的缠在玻璃棒上。析出DNA，使DNA和蛋白质等杂质分开冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用是？DNA的粗提取与鉴别取材、研磨过滤或离心取上清液预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鉴定取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaC1溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。试管编号A（对照组）B（实验组）步骤12mol/L的NaCl溶液5mL步骤2不进行任何处理步骤3步骤4沸水浴加热5min实验现象溶液不变蓝色实验结论加丝状物或沉淀物加4mL的二苯胺试剂溶液逐渐变蓝提取出的白色丝状物含有DNA分子①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂——溶解并提取DNA——析出DNA，使DNA和蛋白质等杂质分开——溶解DNA——鉴定DNA，要现配现用DNA的粗提取与鉴别各试剂作用DNA的粗提取与鉴别（视频）结果分析与评价1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？观察提取的DNA的颜色，如果不是白色状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。DNA的粗提取与鉴别2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？本实验出提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同分析产生差异的原因。从多种方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料，哪种提取方法的效果更好。结果分析与评价DNA的粗提取与鉴别练习1.关于"DNA的粗提取与鉴定"实验，下列相关叙述正确的是(

)A.实验中用95%的酒精预冷后可以更好地溶解DNAB.鉴定DNA时，将粗提产物与二苯胺混合后进行沸水浴C.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去上清液D.本实验可用猪的成熟红细胞置于清水中，待其涨破后释放出DNAB2、下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，正确的是(

)A.取材时可选用鸡血、洋葱、香蕉等富含DNA的材料进行实验B.将白色丝状物置于2mol/L的NaCl溶液中，离心后弃去上清液C.可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来D.鉴定DNA时，应将丝