抗菌肽在畜牧生产中的应用

抗菌肽在畜牧生产中的应用

抗生素作为饲料添加剂广泛应用于动物育种中，对动物育种的发展起着重要作用。它通过抑制或杀灭病原微生物，减少动物的发病率；抑制肠道中有害微生物，维持动物肠道微生态的平衡；使动物小肠重量变轻、肠壁变薄、肠绒毛变长，通过提高动物对养分的吸收率等方式促进动物的生长，提高了饲料的利用率，取得了明显的经济效益。但是，其在动物体内和动物产品中的残留，以及病原菌产生的抗药性问题，对人类的健康和环境产生了负面的影响。寻找新型、安全的抗菌剂代替抗生素，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。抗菌肽（antibacterialpeptides）是生物体产生的一种具有强抗菌作用的阳离子多肽，是生物先天免疫的重要组成成分。1972年，瑞典科学家Boman等首先在果蝇中发现抗菌肽及其免疫功能。1981年Boman等首次从美国天蚕(Hyalophoracecropin)中成功地分离到两种抗菌肽———蚕素(cecropin)A和B。此后，人们在植物、昆虫、两栖类、水产类以及哺乳类动物甚至一些细菌中都发现了抗菌肽类物质。迄今为止，大约有2000多种抗菌肽被分离出来，各种脊椎动物中已发现100多种。在常见家畜中，猪体内已经发现了12种以上的抗菌肽；绵羊体内至少已发现10种抗菌肽基因；牛体内至少已发现30种抗菌肽，牛奶中也分离出3种抗菌肽(赵红霞等，2003;Takumi等，2003；洪奇华等，2001)。经过近20年的研究，人们对抗菌肽的结构、功能及作用机制有了较深的认识。CecropinA、Magainin、Nisi等已先后在医药、食品和农业上得到了应用。1抗菌酶的特性1.1抗菌肽的产生植物没有哺乳动物那样的特异的免疫系统，在生长过程中不可避免地会遭到各种细菌、真菌、病毒等的侵袭，但大部分时间里却不会发病。研究发现，植物体内存在大量的抗菌物质(如抗菌蛋白、抗菌肽等)。硫堇能抑制许多病原细菌(革兰氏阳性和阴性菌)和真菌的生长。植物防卫素能导致真菌显著而持续的钙离子流入和钾离子渗出，从而抑制多种真菌的生长（willem,1997）。在长期进化的过程中，昆虫形成了类似高等动物免疫系统的抗菌、杀菌分子(主要是抗菌肽)的快速合成机制，分泌到血液中，对抗入侵的细菌、真菌、病毒等。受到创伤的蛙在不干净的水中仍能安然存活，其原因是它们体内能产生抗菌肽，抵御病菌的侵害（吴诗光等，2004）。研究发现，极低浓度的爪蟾种类的特异性抗菌肽———蛙皮肽（magainin）就能杀死革兰氏阳性菌和阴性菌、真菌以及原生动物（徐进署等，2001）。Oren等（1996）从豹鳎体上分离到一种抗菌肽（Pardaxin），研究发现，它具有比蜂毒素更强的抗菌活性和更低的人红血球溶血活性。在哺乳动物中，多种白细胞都可以生成总称为cathelicidins的一类抗菌肽，不但具有杀灭多种革兰氏阳性和阴性细菌的功能，某些种类还参与机体的多种其它的生理功能（李朝等，2004）。Hiemstra等(2004)认为抗菌肽是哺乳动物先天免疫的主要中介物质。1.2抗菌肽的合成目前发现的抗菌肽分子量都比较小，如植物防卫素分子量为5kDa左右，一般有45～54个氨基酸残基，含8个半胱氨酸。凤仙花种子中发现的抗菌肽1bAMPs,仅有20个氨基酸残基，是迄今为止在植物中发现的最短的抗菌肽（吴诗光等，2004）。昆虫抗菌肽的4大类中，cecropin含31～39个残基；昆虫防御素含38～43个残基；富含脯氨酸的阳离子肽如apidaccin、abaccin和drosocin等的分子量为2～4kDa；富含甘氨酸的抗菌肽，如diptericin、attacin、sarcotoxin、coleoptericin等的分子量为8～30kDa（徐进署等，2001）。蛙皮素含有21～27个氨基酸的残基。目前，从猪体内发现的12种以上不同的抗菌肽的分子量均小于10kDa(Destoumieux,2000）。这就为利用基因工程的方法对抗菌肽进行大规模的生产，以及对其进行局部的结构改造提供较好的条件。目前有不少抗菌素肽的序列已经分析出来,如:Brevinin1、Tigerinin1、CecropinA、CPF1等（Sitaram等，2000）。Destoumieux等(2004)利用基因工程合成的抗菌肽Penaeidins与天然的Penaeidins在结构上虽有差异,但活性相似。Sung等(2002)将源于猪的Tritrpticin的脯氨酸换为丙氨酸，导致溶血作用提高而抗菌活性无明显变化。抗菌肽在沸水中煮30min仍不变性失活，能耐受饲料制粒时的高温作用，规模化发酵生产抗菌肽时经高温浓缩工序，可充分杀灭酵母菌体而不导致抗菌肽失活，使产品在推广应用后不会出现因工程菌的扩散而导致的环境生态问题（温刘发等，2005a）。1.3抗菌肽的抗菌机理抗菌肽的抗菌机理与传统的抗生素有较大的不同。传统的抗生素主要是细菌的发酵产物，由酶促反应合成，通过抑制细菌细胞壁或DNA的合成而发挥作用，发挥作用时需与细菌细胞膜或胞内特异的受体结合，细菌容易通过变异而产生抗药性。而抗菌肽则是由宿主基因编码，在核糖体上合成的，它的抗菌机理目前主要认为与离子通道的形成有关。大多数抗菌肽分子是带正电荷的，可以与细菌胞浆磷脂分子上的负电荷通过静电吸附而结合在脂质膜上，使脂双层外侧发生扭曲，细胞膜产生相变，产生短暂的离子通道。这是通过物理作用造成的细胞膜穿孔，不需要特殊的受体，因而它可以杀灭微生物而不产生抗药性(Andre等，2003)。1.4无杀害作用高等动物肠道微生物菌群发达，不同动物的肠道内源性抗菌肽能抑制其相应的外源性病原菌，而对动物肠道中共生生态系统中的微生物和动物细胞无杀伤作用,即高等动物肠道抗菌肽具有“种”特异性。尽管高等动物肠道抗菌肽具有此优点，但它们在动物体内表达分泌量有限，加上现代畜禽饲养业日益呈集约化，病原传播和入侵及各种应激作用日益强化，使得畜禽肠道表达量有限的抗菌肽更难以对动物自身的保健起很大作用。应用各种动物的专一性内源性抗菌肽作饲料添加剂，可使饲养动物在受到外源病原菌入侵或应激时能特异性地维持其健康和生长（温刘发等，2005a）。2作为饲料添加剂的应用效果2.1猪小鼠抗菌肽的抗菌活性抗菌肽由于其作为饲料添加剂的众多优点，正引起人们的关注，有望成为替代抗生素的产品之一。目前，不少研究者做了一些相关的试验，得到了较好的结果。马卫明等(2005)检测了猪小肠抗菌肽对鸡大肠杆菌(O1)C83845株、鸡白痢沙门氏菌C79-13株、大肠杆菌(O2)、大肠杆菌(O78)、猪致病性大肠杆菌自然分离株、鸡致病性大肠杆菌自然分离株、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌ATCC25923株、猪致病性沙门氏菌自然分离株、绿脓杆菌ATCC27853株、鱼致病性嗜水气单胞菌等11株细菌的作用。结果发现，猪小肠抗菌肽对以上各株细菌均有不同程度的抑制作用，杀菌率59.5%～98.5%不等。汪以真等(2004)将抗菌肽与抗生素在体外抗大肠杆菌(E.coli)K88、大肠杆菌ATCC25922、猪霍乱沙门氏菌ATCC50020、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌ATCC25923的效果进行了研究。结果表明，抗生素抗金黄色葡萄球菌的效果要好于抗菌肽，但对大肠杆菌的效果要差得多。2.2抗菌肽对鸡的影响目前，国内作为添加剂生产应用的主要是蚕抗菌肽AD-酵母制剂，大多数的畜禽试验也是围绕这种抗菌肽进行的。温刘发等（2001b）通过在断奶仔猪的饲料中用抗菌肽代替抗生素，对仔猪的腹泻、生产性能等作了比较。结果表明，抗菌肽在仔猪断奶应激期间抗腹泻效果不比抗生素差，适量的抗菌肽比抗生素促生长的效果要好，但高剂量的抗菌肽则降低了仔猪的生长。黄永彤等(2004)发现，抗菌肽对肉鸡有促进生长和提高免疫力作用，与中草药抗生素相比，在出栏率、平均体重、饲料效率等方面均无显著性差异，且在出栏前3d停喂，抽检无残留。温刘发等(2001a)通过饮水方式给粤黄鸡添加抗菌肽的饲养试验结果表明，抗菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含量。陈晓生等(2005a)于肉鸭日粮中添加液体的蚕抗菌肽AD-酵母制剂发现，血清代谢激素的活动显著增强，IGF-1浓度升高，营养物质合成加强；甲状腺素T3升高，脂肪、T4降低；尿素氮浓度显著降低，体内氮排出减少。陈晓生等(2005b)发现抗菌肽能使肉鸭的产肉率提高，腹脂率、内脏器官比重降低，在适当剂量时，使用效果与金霉素基本一致。陈晓生等(2005c)发现，添加抗菌肽制剂2ml/kg能有效提高肉鸭生产性能，尤其是小鸭阶段（1～2周龄）效果显著；2、3ml/kg添加量均可显著提高产肉率。从尿素氮和总蛋白浓度结果看，添加抗菌肽会使机体在蛋白质合成量变化不大的情况下减少机体蛋白质的分解代谢，从而促进生长。王广军等(2005研究了抗菌蛋白在南美白对虾养殖中的应用效果。结果表明，在饲料中添加抗菌蛋白，无论是在日生长速度、相对增重率、饲料系数、成活率，还是抗病力方面均有显著提高。此外，国外有报道称，抗菌肽对饲料防霉也有一定的效果。3抗菌肽的相互作用抗菌肽代替抗生素作为饲料添加剂的研究最近几年才发展起来的，还处于探索阶段，距形成成熟的技术，大规模的应用到动物生产中还有很多问题需要解决：(1)抗菌肽的种类很多，哪些种类作为饲料添加剂效果较好而且又比较经济；不同种类的抗菌肽之间是否有相互作用，有待于进一步研究。(2)抗菌肽在动物体内含量少，天然资源缺乏，而且由于其具有广谱的抗菌作用，很难利用微生物进行生产；化学合成的生产成本昂贵，目前还无法投入大规模的生产（邱晓燕等，2002）；用