代谢组学与中医证候研究

代谢组学与中医证候研究

作为中医学的一种独特的辨证论治模式，其精髓是中医辨证论治的本质，是中医理、法律和法规的桥梁和关键。随着现代医学和科学技术的飞速发展,传统中医学向现代中医学的转化已成为中医学术发展不可逆转的潮流,其中证候研究又一直是中医药现代化研究最主要的攻关对象。近50年来,许多学者借助现代科技,用临床研究和动物实验对五脏证、阴阳证、寒热证、血瘀证等的本质进行了不同层次与多角度的探讨,也取得了一些可喜的成绩,但总体而言,尽管结果指标找到不少,但真正能用于中医临床的却少之又少,既没有找到证的特异性指标,也没能促进中医理论的根本创新与发展。证候研究到底路在何方,近些年来兴起的代谢组学技术以其全新的理念与方法似乎使人们看到了一丝新的曙光。1现代辩证法与证据本质的研究1.1证候及证候要素证的传统含义虽然是基本清楚的,但随着证本质研究的深入,证的概念也不断被赋予新的内涵。普通高等教育“十五”国家级规划教材《中医辨证学》把“证”定义为“是机体在疾病发展过程中某一阶段的病理概括,它包括了病因,病变部位、性质以及邪正关系,反映出疾病发展过程中某一阶段的病理变化本质”。沈自尹则把“证”定义为“一种综合性功能态,有具体的功能网络和调控中心”。宋剑南认为,证候是通过四诊手段获取的机体在某一时空条件下对各种内外因素(包括机体生理功能及生物、化学、环境、精神、气候等各种致病因子)的整体性反应而呈现的生理、病理信息的综合判断结果的表述。证候也可简称反应态,具有整体性、时空性、传变性和个体差异性等特点。王永炎等从证候要素的视角解释道:“任何一种证候都是由若干证候要素和证候要素靶位组成,其中证候要素是对证候病因病机的表述,证候要素靶位是关于证候要素发生部位的厘定。”任一证候要素或证候要素靶位都具有不同于其他证候要素或证候要素靶位的特异性症状、体征及其组合。可见,随着现代医学科技的发展,人们对证内涵的认识也是不断变化与深化的。1.2方证和证候的一致性研究自从20世纪60年代初开展肾本质研究以来,证本质研究大体经历过几个发展的高峰时期,如20世纪70年代后期的证候动物模型研究,80年代中期的证候微观指标客观化研究,以及21世纪初的病-证-方的物质基础纵深研究。纵观近半个世纪的证候研究成果,现有的大多数动物证候模型与人类证候的一致性尚存在诸多争议,试图以单个或几个微观指标来取代证候宏观诊断的设想已被认为几无可能,而方证相应(互证)虽然符合中医临床实践,但中医浩如烟海的方剂及其临床使用的灵活性又使得这种研究思路与辨证论治的初衷渐行渐远。当然,在这些研究中,肾虚证、血瘀证等证本质的研究独树一帜,在中医现代化研究中具有里程碑意义,为其他证候的研究起到了示范性作用。2证候研究的技术价值从人们对证候内涵认识的不断变化我们可以看出,证候虽然在宏观上有明确的专业表述,但在微观本质上则是随人类对自身生理病理的洞察而不断深入的。近年来人们借鉴还原论的方法,分别从生化、生理、超微结构、神经-内分泌-免疫网络以及基因及其表达、调控等方面探讨了证的实质,虽然多数研究都反映了不同证候特定的部分生理生化指标或者基因表达产物等的改变,但这远未揭示出证的本质。对于中医药这一复杂性科学,证候研究最终还是要围绕其核心理论即整体观、恒动观等来展开的,而不是简单地使用还原论的方法,这就需要有新的科技手段作为支撑。近期兴起的以综合、集成、整体研究为特点的系统生物学研究方法,无疑为这一问题的解决提供了契机。系统生物学的理念与中医学的整体观、系统观和辨证论治思维非常吻合,也与中医重视从人与自然,人与社会和人体内在的普遍联系及动态变化去分析、认识、把握疾病发生、发展、变化的客观规律的认识相一致。同时,要进行证本质的研究,科学规范的证候诊断是其不可逾越的前提,血瘀证和肾虚证研究的成果也充分证实了这一点。由于证候是在四诊基础上对疾病内在规律的抽象概括,传统上主要依赖医生的主观经验进行判定,所以在诊断上存在很大的差异性和模糊性,难以达成共识。因此,制定证候的统一、客观乃至量化的宏观诊断标准是进行证本质研究的重要前提之一。当前,研究者多采用流行病学的方法,通过望、闻、问、切,将四诊所获得的信息进行整理,研究其中一些普遍性的规律以建立相应的诊断标准。但是,由于受四诊的主观性、抽样的差异性以及统计分析的复杂性等因素的影响,使得多数证候的诊断标准或其研究方法尚难以获得业内的认可。因此,证候宏观研究一方面要注重引入模糊数学、拓扑学等先进科学手段,提高其研究水平,另一方面可以尝试从寒热证候、虚实证候等一些简单、相反的基本证候入手,由浅入深地逐步推进。3代谢组学理论代谢组学作为系统生物学的组成部分,是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科,是一门“在新陈代谢的动态进程中,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质”的科学。它强调把人体作为一个完整的系统来研究,通过测定人体各种体液内代谢物的组成变化来认识和反映人体代谢网络在疾病和药物影响下的代谢模式。具体而言,代谢组学的研究过程包括前期的样本制备,中期的代谢产物分离、检测与鉴定,以及后期的数据分析与模型建立3个部分。其样本主要为尿液、血浆或血清、唾液以及细胞和组织的提取液等。代谢物的检测、分析与鉴定是代谢组学的核心,目前主要的技术手段包括核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)、液相色谱-质谱联用(liquidchromatography-massspectrometry,LC-MS)、气相色谱-质谱联用(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)等。NMR具有无损伤性,不会破坏样品的结构和性质,样品前处理简单,可在接近生理条件下进行实验;NMR没有偏向性,对所有化合物的灵敏度是一样的,谱峰位置和强度可定性和定量,可在一定的温度和缓冲液的范围内选择实验条件;可以进行实时和动态的检测;可设计多种编辑手段,实验方法灵活多样。尽管NMR对样本制备要求少,但其灵敏度较低,检测到的物质少,且结构定性难是其存在的缺陷。质谱(massspectrometry,MS)技术是将离子化的原子、分子或是分子碎片,按质量或是质荷比(M/Z)大小顺序排列成的图谱,并在此基础上进行各种无机物、有机物的定性或定量分析。其中GC-MS定量重现性好,是最成熟的技术,分辨率和灵敏度高于NMR,具有成熟的商业标准品数据库,然而其只能检测有挥发性的物质和可衍生的亲水性物质。LC-MS灵敏度和选择性比NMR高,也避免了GC-MS繁杂的样品前处理,然而其基质抑制影响定量准确性,稳定性没有GC-MS高。因此,NMR技术与MS技术各有其优缺点,需要在研究中灵活选用。4从生物活性的角度学代谢组学技术作为系统生物学研究中相对成熟和极为重要的手段,在进入国内后不久即被迅速用于中医证本质的研究。罗和古等基于代谢组学的理念,提出“证是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反应的一种功能状态,其外候表现为一组有相互关联的症状和体征群,其本质是机体失衡而致的代谢或其网路的改变”。当前,人们主要从动物实验和临床观察两方面来进行中医证候的相关研究。4.1基于动物模型相关测试的研究4.1.1不同分析方法对离子型肝郁证的影响徐舒等采用慢性束缚的方法造成肝郁证大鼠模型,运用1H-NMR技术对模型组和对照大鼠血清进行代谢组学分析。研究发现,模型组血清中葡萄糖和肌酸的含量明显偏高,而3-羟基丁酸、谷氨酰胺、磷脂酰胆碱、磷酸胆碱和不饱和脂肪酸的含量明显偏低,从而得出结论,这些差异小分子物质构成“肝郁证”的代谢标志物群,有助于阐释肝郁证的本质。王伟明等则采用夹尾法制备肝气郁结证大鼠模型,对其尿液进行NMR检测后发现,模型组大鼠尿液与对照组相比,马尿酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、异柠檬酸和乌头酸的含量减少,肌酸酐、丙酮、乙酸、肌酸、烟酸和5-羟基吲哚-3-乙酸含量则明显增加。陈斌等也采用夹尾法建立肝气郁结证大鼠模型,并在造模成功后给予柴胡疏肝散干预。通过NMR检测发现,模型组大鼠尿液马尿酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、异柠檬酸和乌头酸含量减少,肌酸酐、丙酮、乙酸、肌酸、烟酸和5-羟基吲哚-3-乙酸的含量显著升高;而在给予柴胡疏肝散灌胃干预后,治疗组大鼠尿液的肌酸、丙酮和肌酸酐含量明显减少,N-氧化三甲胺、氧化三甲胺与牛磺酸含量明显增加,提示柴胡疏肝散能够部分调控肝气郁结证异常的代谢产物,促使代谢表型向正常范围回归,对肝气郁结证大鼠代谢紊乱有一定的恢复作用。4.1.2大鼠血浆成分变化简维雄等用结扎冠状动脉左前降支的方法制作了大鼠心血瘀阻模型,运用GC-MS进行血浆代谢组学研究,同时检测各组血液流变学指标。大鼠血浆样品散点图显示,模型组与空白对照组、养心通脉方组、假手术组完全分离;因子载荷图表明,乳酸、丙氨酸、缬氨酸、琥珀酸、苹果酸、硬脂酸、花生四烯酸含量明显增高,果糖含量明显降低;采用养心通脉方干预后其代谢物含量、血液流变学指标均有不同程度的回调。认为发生改变的上述8种代谢物与反映“血瘀”病理的血液流变学指标改变具有一致性,有可能作为心血瘀阻证的代谢性生物标志物。4.1.3肾髓质毒性通过-酮戊二酸、恶意化合物含量的变化李林等依据中医“劳则气耗”的理论,采用睡眠剥夺法制作大鼠气虚血瘀模型,利用NMR进行尿液代谢组学研究。结果显示,模型组大鼠尿液的肌氨酸酐含量增加最为明显,可能预示着肾小管损伤和肾毒性的存在,提示气虚证可能与肾功能异常有着密切关系;同时,氧化三甲胺、柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸的含量变化可能预示着肾髓质毒性的存在。这与中医论述“劳则气耗”所致的气虚血瘀证表现出的全身机能减退症状以及循环系统改变有一定的吻合之处。王勇等通过在左冠状动脉前降支放置Ameroid缩窄环制备冠心病慢性心肌缺血小型猪模型,并结合宏观体征、冠状动脉造影和超声心动图等方法确立了气虚血瘀证,采用GC-MS和模式识别技术,分析冠心病心肌缺血气虚血瘀证模型与假手术组小型猪12周血浆的代谢物及相应代谢物谱群的变化。结果显示,在气虚血瘀证早期,氨基酸、糖代谢与脂类代谢紊乱,三者相互作用,引起能量代谢中三羧酸循环平衡被破坏,柠檬酸含量下降。这些病理改变可能进一步加重冠心病气虚血瘀证,其中柠檬酸、葡萄糖、硬脂酸、棕榈酸、甘油、醋酸等化合物的浓度变化较大,这些代谢物的变化模式有望成为临床诊疗冠心病气虚血瘀证的参考指标,并为研究证候的客观化提供新的思路。4.1.4不同分组细胞的代谢图谱Chen等采用注射氢化可的松的方法制作大鼠肾阳虚证模型,运用GC-MS分析方法进行尿液代谢组学研究。与正常组相比,模型组体内代谢网络在代谢图上反映出不同于正常组的分布图谱。而经温阳中药肉苁蓉干预后的肾阳虚对照组的代谢图谱偏离模型组,回归至正常范围,呈现网络修复的结果,并接近于正常对照组。表明代谢组学通过研究体内代谢网络的相应变化及代谢物的差异,有望在中医证型研究上作为一种新的可“计量”的诊断或评价手段,对基于“辨证论治”的中药药效作用评价具有较大的应用价值。4.1.5大鼠阴道代谢分类结果卢江等以肺炎链球菌诱导肺热证候模型,运用超高压液相色谱-四级杆-飞行时间质谱对其尿液代谢组学进行检测。结果显示,模型组大鼠尿液的代谢轮廓发生改变,并且在得分图中代谢物组发生明显偏移。随着造模后所处时间段的不同,其代谢产物发生了一定的变化,分类趋势越加明显,在造模后第5天达到最大值。所得出的代谢组学研究结果与肺热证候的宏观体征及病理生化指标结果相符。4.2疾病的证据性质研究4.2.1糖代谢明显异于健康志愿者蒋海强等对17例Ⅱ级高血压病肝阳上亢证患者及8例健康志愿者的血清样本进行NMR分析发现,肝阳上亢证患者体内部分氨基酸代谢和葡萄糖代谢明显异于健康志愿者,这为理解高血压病肝阳上亢证的证候本质及该类病证的辅助诊断提供了依据。陆益红等对32例健康人及33例原发性高血压病患者(其中肝火亢盛17例、痰湿雍盛8例及阴虚阳亢8例)的血清内源性代谢物进行GC-MS测定,健康人与高血压病患者的血清代谢物谱具有明显差异,进一步采用Mahalanobis距离判别法不仅可清晰区分3种不同证型的高血压,还能显示高血压的发展过程。4.2.2gc-tof/ms检测简维雄等采用GC-MS技术对6例冠心病心血瘀阻证患者、16例非心血瘀阻证患者及10例健康志愿者血浆代谢产物进行检测发现,花生四烯酸、硬脂酸、乳酸、尿素、柠檬酸、β-羟基丁酸、油酸、葡萄糖和丙氨酸为冠心病心血瘀阻证患者的血浆差异代谢产物,其不仅与脂质代谢、糖代谢相关,也与缺氧、剧痛引起的应激相关。张红栓等对10例冠心病心绞痛痰浊证患者和10例血瘀证患者的血浆样本进行NMR检测,发现两组血浆样本中与能量代谢相关的代谢物差异显著。王广基等采用气相色谱-飞行时间质谱(gaschromatography-timeof-flight/massspectrometry,GC-TOF/MS)技术对29例冠心病痰阻心脉证患者、14例冠心病气阴两虚证患者及27例健康志愿者的血液样本进行检测。结果表明,两证型患者的多个内源性代谢物的含量存在明显差异,显示其与能量代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢异常相关;同时,利用偏最小二乘法判别分析(partialleastsquares-discriminantanalysis,PLS-DA)法建立的痰阻心脉证和气阴两虚证数学模型参数与临床中医症状分级量化指标具有显著的相关性,提示代谢组学所研究的体内小分子化合物可能正是中医分型的物质基础。华何与等对18例健康人和18例冠心病心绞痛血瘀证患者(其中气滞血瘀证、心血瘀阻证和气虚血瘀证各6例)的血浆样本进行NMR检测,发现心绞痛血瘀证患者血浆的柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖、乙酰糖蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、3-羟基丁酸、谷氨酸、脯氨酸及亮氨酸含量较高,高密度脂蛋白、不饱和脂肪酸、苏氨酸、组氨酸含量则较低;进一步分析发现,气虚血瘀证组与其他两类血瘀证组代谢谱差别较大,而气滞血瘀证与心血瘀阻证两组间差异不明显,提示代谢组学方法对于研究冠心病心绞痛中医证候具有重要价值。朱萱萱等对29例健康志愿者和90例不同证型冠心病患者(其中痰阻心脉型患者31例,气阴两虚型患者18例,气虚血瘀型患者29例及气滞血瘀型患者12例)的血清进行GC-TOF/MS检测,结合PLS-DA法。结果表明,该方法不仅可有效区分疾病组和健康对照组,并能将男性患者中的气虚血瘀型和痰阻心脉型,女性患者中的气虚血瘀型、痰阻心脉型和气阴两虚型明显区分开来,提示基于GC-TOF/MS和模式识别的代谢组学技术在揭示传统中医理论本质上有着广泛的应用前景。4.2.3有极量代谢相关的感冒严兴海等对39例肾虚痰瘀型哮喘患者和40例健康人的血浆进行NMR检测,发现肾虚痰瘀型哮喘患者代谢产物标志物的产生不仅与气道炎症、气道超敏反应和气道重塑等哮喘病理生理变化密切相关,还与哮喘发作状态下机体的能量代谢改变有关,提示肾虚痰瘀型哮喘患者可能存在长期持续耗能与免疫功能紊乱的状态,而气道炎症持续刺激可能是导致这种状态的主要原因。这为进一步认识肾虚痰瘀型哮喘的微观物质基础、评价中医药对肾虚痰瘀型哮喘的干预效果提供了初步的证据。4.2.4痰瘀证肿瘤患者代谢活性成分变化巴吐尔·买买提明等通过对460例肿瘤患者(包括痰瘀证患者356例和非痰瘀证患者104例)和50名健康人的血浆进行NMR检测,发现肿瘤患者血浆中多种氨基酸水平显著下降,葡萄糖、糖蛋白、谷氨酰胺、鲨肌醇、乳酸、胆碱、肌酸水平也明显下降,甲酸、丙酮、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、β-羟丁酸、肉碱、丙二酸、不饱和脂肪酸、极低密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量则明显升高。与非痰瘀证肿瘤患者比较,痰瘀证肿瘤患者血浆中亮氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、组氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等多种氨基酸以及谷氨酰胺、肌醇、鲨肌醇、乳酸、肌酸等代谢物含量明显偏低,而丙酮、乙酰乙酸、不饱和脂肪酸、极低密度脂蛋白、α葡萄糖、β葡萄糖、糖蛋白等代谢物含量则明显升高,提示肿瘤患者体内脂肪代谢加强,多种氨基酸下降,细胞抗氧化能力下降,而痰瘀证肿瘤患者体内的代谢紊乱程度可能比非痰瘀证肿瘤患者更为严重。赵晓山等采用病证结合的方法,以慢性胃炎和消化性溃疡患者为观察对象,应用NMR仪对19例脾气虚证患者、12例湿热蕴脾证患者及12例健康人的唾液进行检测发现,脾气虚证组患者唾液中谷氨酰胺、蔗糖、乳酸盐、苯丙氨酸的含量相对较高,湿热蕴脾组患者唾液中乙酸、丙酸盐、牛磺酸的含量相对较高。以上物质可作为脾气虚证、湿热蕴脾证的辨证参考指标,同时在一定程度上印证了中医“脾在液为涎”理论的科学性。5中医证候研究的模型构建证是中医整体观和辨证论治观的具体体现,更是中医基础理论研究中的关键科学问题。但证候所具有的整体性、时空性、个体差异性等特点,使得传统以还原论为主的研究思维难以实现对证候研究的降维与整合,这也使证本质研究成为中医理论研究中的主要难点之一。作为系统生物学的代谢组学,它能够多层次、多靶点、动态性地研究和表达集体的功能状态,可以通过代谢物的变化实时表达外源性扰动带来的功能变化,其整体性及动态的功能性与中医证候对病理状态的表达理念相吻合。因此,将代谢组学理念与方法引入中医证本质研究具有重要的现实意义。当前,代谢组学技术应用于中医证本质的研究虽然已取得了一定成果,但仍存在诸多不足。如通过制备相应证候的动物模型来进行证本质研究,虽然动物模型有一致性好、条件可控、观察周期快、取材方便等诸多优势,但目前多数中医证候的动物模型尚难以得到业内公认。例如,在动物证候模型判定上,传统中医通过望、闻、问、切来进行诊断,其方法显然难以复制于动物;同时,