寒热证动物模型研究进展

寒热证动物模型研究进展

本文在过去15年中对软寒热综合征的一般模型进行了如下研究。1冷杉动物模型1.1寒凝瘀证的制备黎敬波等选用Wistar大鼠进行胃溃疡实寒证造模。给大鼠微量注射20%醋酸造成大鼠胃溃疡,再灌饲冰水施加寒性刺激,第7d开始检测指标,成功制成胃实寒证模型。陈艳芳等采用冰NaOH或冰水+NaOH造成胃寒Ⅰ°和Ⅱ°模型,多次试验结果证实造模大鼠的一般状况、胃黏膜的病理组织形态、微观指标变化等都符合中医临床寒证的表现,并以温性药为主的反左金丸反证了寒证模型的成功。《内经》云:“……寒独留,则血凝泣,凝则脉不通。”寒则凝,凝则成瘀,故寒邪易致寒凝血瘀。郑小伟[3、4]以中医理论为指导,运用现代科学技术手段,在正常大鼠测定呼吸频率后,将其置于罩有铁网的瓷盘上,放入-15℃冰箱中持续受冻4h左右,当动物处于兴奋减弱期时复制出寒邪伤阳所致的阳虚寒凝血瘀证。吴垦莉等对家兔后肢局部冷冻,引起紫绀、水肿等症状,造成家兔寒凝血瘀证动物模型,以造模后第3~5天各项病理形态学变化最为明显。王学江等用同样的方法建立了小鼠寒凝血瘀证模型。倪瑾[7~8]等将冷冻组家兔的双侧后肢上、下、左、右围置低温冰袋(-25℃~-20℃),冷冻1.5h,1d~5d后复制出寒凝血瘀模型。成秀梅等人则将大鼠置于0℃~1℃冰水中20min,每日1次,连续2周,造成寒凝血瘀证大鼠模型,并经温经汤进行方药反证,大鼠寒性症状明显改善。寒凝血瘀证模型多以受试动物的血液流变学、微循环、血凝、血栓素、血流量等指标作为模型评价依据。杨士友等根据中医“风为百病之长”的理论,将SD大鼠置于模拟风(5~6级)、寒(3℃~7℃)环境中,前期(6d)表现符合中医风寒表证的症状;后期(14d)表现符合中医的寒凝血瘀证,见血液增黏、增稠、增聚,微循环流态恶化,微血管管径、流速、流量降低。此外,还有在肾上腺素+寒冷刺激的复合因素作用下造寒凝血瘀证模型。滕久祥等[11、12]采用皮下注射0.1%盐酸肾上腺素2次,并在给药之间于5℃~8℃水中浸泡5min的方法造成大鼠寒凝血瘀模型。蔡铮等运用静脉注射大量肾上腺素加冰水浴造成寒凝血瘀证家兔模型。1.2制备200%的水饼由于味苦性寒凉中药易伤阳气,阳虚则内寒,长期大量灌胃寒凉药的大鼠可呈现出寒证的某些特征,以脾阳虚为主。陈小野用山栀子、黄芩、龙胆草、莲子心、知母(1∶1∶1∶1∶1)制成水煎剂,1.5g/只,1次给药,30min出现虚寒症状,制成寒证模型。此外,他也用利血平肌注,用药量10ug/只/d,7至8d可造成虚寒证动物模型。该模型从第5天起出现较稳定的中医临床寒证特点。周小军等选用清洁级豚鼠,用知母、黄柏、生石膏、龙胆(1.5∶1∶1∶1.5)制成180%水煎剂灌胃,每天10g/kg,1次给药,用药4周制成豚鼠寒证模型。李良等在梁月华早期建立的动物模型基础上进一步改进造模方法,直接用知母、石膏(1∶1)制成1kg/L的水溶液,灌胃Wistar雄性大鼠,每天1次,4ml/只,3周后制成虚寒证模型。宋辉等用知母、石膏(3∶4)制成100%的水煎剂,4ml/d,1次灌胃Wistar雄性大鼠造模,3周后制成虚寒证模型,停止喂药后虚寒状态持续7d以上,并认为是研究药物治疗的良好模型。陈小野等对上述虚寒证的造模方法进行了总结,认为以上虚寒证模型虽基本得到了公认,但存在两个环节的不足:一是可能未能在寒证的基础上达到寒邪伤阳而致模;二是虚证尚未达到“精气夺则虚”的程度。于是加大造模剂量,延长造模时间,选择雌性WistarII级大鼠按体质分组,用知母、生石膏、黄柏、龙胆草(1.5∶2.0∶1.0∶1.2)常规制成200%煎剂,灌胃28d后,模型有较深程度的寒证表现,并出现虚证。邱赛红等人选择分别用冰食醋或氢氧化钠给大鼠灌胃建立寒证模型,认为食醋法造模所制备的脾胃虚寒模型较氢氧化钠稳定,并与中医寒证更接近。周灿平等选用KM种小鼠,采用控制饮食+游泳的方法复制出体虚模型,实验动物出现典型的临床“虚寒证”特点。2热效应动物模型2.1中医临床热证“气有余便是火”,气过盛则易出现火象,表现为实火、实热证,因此补气药可用于实热证造模。梁氏等选用雌性大白鼠,首先喂党参、黄芪1周,随后自皮下注射致热物松节油2ml引起发热,体温可达40.30℃,持续3d,随后恢复。此种方法克服了单纯用党参或单纯用松节油只引起发热,而交感神经和内分泌变化不大的缺点,更符合临床实热证病人的表现。陈群等用党参、黄芪(1∶1)制成1g/ml的水溶液,4ml/d/只,2周后成功造出实热证模型。黎敬波以化学因素、中医传统病因、客观指标为根据,选用Wistar大鼠进行胃溃疡实热证造模。采用20%醋酸微量注射导致胃溃疡,然后施加病因刺激,灌饲辣椒汁、白酒混合液,造成胃实热证模型。第7d开始检测指标,结果表明胃溃疡实热证模型组造模成功。陈艳芬等采用乙醇或辣椒+乙醇造成胃热Ⅰ°和Ⅱ°模型,多次试验结果证实,造模大鼠的一般状况、胃黏膜的病理组织形态、微观指标变化等都符合中医临床热证的表现,并以左金丸反证了热证模型的成功。山丽梅采用辣椒汁加60°白酒灌胃两周,最后3d夹尾激怒的方法成功建立了大鼠胃热证模型。周灿平等选用KM种小鼠,采用饲喂高蛋白饲料的方法复制出体盛模型,实验动物出现典型的临床“热证”特点。田在善以化学因素、客观指标、药物反证为依据复制动物模型,给大鼠尾静脉注醋酸铅、5-羟色胺后,立即经胃内灌注脂多糖,进行肠源性内毒素肠热证造模。其造模结果与中医肠热腑实证基本吻合,且大承气汤具有明显的保护作用。另外,模拟发生热性病的病因,以细菌、病毒、内毒素等作为致毒材料,通过给动物体内注大肠杆菌、巴氏杆菌、肺炎双球菌产生内毒素而发热,或直接注入内毒素而引起实热证,动物多选用兔或大鼠进行研究。2.2中医模型的建立虚热证动物模型是中医证候动物模型中研究较多的1种。以北京医科大学研制的较为典型,他们使用温热类中药,以热甚耗伤阴液为病机,制成虚热证模型。如用附子、干姜(1∶1)制成100%水煎剂,每日4ml,1次灌胃,3周即可。陈小野等也选用温热类中药如附子、肉桂、仙茅、仙灵脾等份制成水煎剂灌喂雌性小鼠,用药7d,小鼠表现出一系列的虚热症状。或附子、干姜、麻黄、苍术、猪苓等份水煎剂灌喂大鼠,共26周。通过胃黏膜检测和舌象观察,其症状基本符合中医阴虚热盛证的表现。陈群用附子、干姜、肉桂(1∶1∶1)制成1g/ml的水溶液,4ml/d/只,2周后成功造出虚热证模型。周小军等选用清洁级豚鼠,用附子、干姜、肉桂(1∶1∶1)制成180%水煎剂,每天10g/kg灌胃,每天1次,用药4周制成豚鼠热证模型。施天华等用附子、干姜(1∶1)制成100%水煎剂,每日4ml,1次灌服,喂药3周造成虚热证模型。周永生等改进现行的虚热证动物模型,加大造模剂量,延长灌胃时间,选择雌性WistarII级大鼠,按体质分组,用熟附子、肉桂、干姜(1∶1∶1)制成200%煎剂灌胃,4ml/只,每天1次,再以肉桂、干姜(1∶1)制成200%煎剂灌胃,4ml/只,每天2次(实验第17天起3次/d),用药28d,发现造模大鼠不但有热证表现,而且有一定的虚证表现。梁念海等选用SD大鼠,用温热中药干姜作为造模工具药,给大鼠灌胃干姜水煎剂复制出胃热证动物模型,并且发现中、高剂量的干姜水煎剂与辣椒汁和白酒(50%)混合液效果相当。汪文娟用昆明种小鼠灌胃附子干姜肉桂水煎剂,同时5%乙醇代水随意饮用,3周后造出胃阴虚热证病理模型。王秋等选用日本大耳白兔,先用禁水禁食和速尿二度利尿脱水造成“阴津亏虚”状态,再以注射大肠杆菌内毒素以致“热盛”,使受试对象产生阴虚内热的表现。3心温、热、常体等体质模型的筛选动物证的模型以从动物中筛选优于复制,这符合“证根源于体质”的思想。周志东等选用3月龄SD雄性青年大鼠,于实验前1月测定大鼠掌温,每1~2周测温1次,以各鼠掌温高于或低于群体均值1℃以上者筛选“热体”或“寒体”动物。叶福媛等通过测量大鼠蹠心温度3d,从Wistar大鼠自然群体中,以群体蹠心温的均值为标准筛选出寒体、热体、常体等体质模型。张福利等每日测量Wistar大鼠体温(肛温)2次,连续4d,按体温稳定在36.2℃±0.3℃为寒体、37.2℃±0.2℃为常体、大于37.8℃±0.2℃为热体的标准筛选寒热体质模型。韩巍等通过测定SD大鼠肛温,每日1次,雌鼠连续测定6d,雄鼠连续5d,以雌鼠、雄鼠群体的平均肛温为标准,筛选出寒热体模型。陈小野等选用10种北京市目前常用的Wistar实验大鼠Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、SDⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级、CD(SD)IGSⅢ级(小体重组)、CD(SD)IGSⅢ级(大体重组)、SHRI级、SHR/spⅠ级,通过检测外观、舌象、下丘脑-垂体-甲状腺轴功能,运用中医学理论进行体质初步分析,筛选出虚寒、虚热、实热、正常等体质的大鼠。陈氏等又以8~9周龄昆明、BALB/c、C57BL/6J、ICR小鼠,以及4~5周龄昆明小鼠为研究对象,同步系统检测其生物学特性,然后以统一的标准评价了这4种品系小鼠的寒、热体质。4中医证候动物模型的复制和验证近10余年来,国内学者对寒热证动物模型的研制做了许多有益的探索,产生了一些原创性的造模方法和评价标准,推进了动物模型的标准化、客观化进程,并对其他相关中医证候模型的成功复制起到了一定的示范和引领作用。首先是多指标合参思想评价动物模型的引入,更加符合中医临床上以微小证候群为病理基础的“证”的宏观整体特征。其次表现在对寒热证型虚性病理的处理上,根据中医阴盛(寒)必然伤阳,阳盛(热)必然伤阴的理论,有些研究者开始通过加大造模剂量,延长造模时间,分别复制出阳虚或阴虚的寒热证候动物模型,使其在寒热证病理存在的同时保证虚证的存在。另外,以保持自身原有机能状态为特征和优势的寒热自然体质模型的提出和研究也为动物模型拟临床病理状态提供了一种新的模式和方法。尽管如此,寒热证动物模型的复制仍存在诸多不足和歧义,远未取得突破性进展。就目前来看,寒热证动物模型的复制仍多采用寒热温度刺激或寒热性药物等某一单一因素刺激致病,这显然有悖于临床上病人致病因素多样化的客观情况,另外,施加因素的刺激强度以及作用时间也缺乏合理的客观依据和标准。可见,拟临床病因的多元化致病因素的联合应用研究及其相关标准的建立仍是今后尚需加强和重点研究的方向和领域之一。模型的判定和评价是动物模型制备过程中的一个关键环节,也是模型成功与否的决定因素。尽管寒热证动物模型的评价指标趋于多样化,但缺乏与“证”的病理相对应的特异性强的客观指标,而这些客观指标的获取和建立则有赖于证候的客观化研究。关于这方面的研究,可以借鉴肾阳虚和脾虚证本质研究的思路和成功经验,以临床病人为突破口,通过选择典型的寒热证病人,收集血液、尿液、唾液等容易获取的样本,进行生化及组学分析,发掘能够表征中医“证”的病理状态的生物学信息,应该是一条探寻寒热证“生物标记物”的有效途径。总之,中医证候动物模型的研制只有在立足于中医学整体思维模式的基础上,充分汲取分子生物学、生物信息学、系统生物学等现代生命科学知识,并不断融合数学、化学计量学及数据挖掘等方法和手段,提取证候的现代生物学信息,才能逐步增加具有量化标准的客观指标在证候判断