知母中总皂苷提取工艺的研究

知母中总皂苷提取工艺的研究

知母是百合科植物知母的母亲。它对清热、腹泻、入液和干燥也很有效。最近有研究表明,知母皂苷元还有抗衰老、提高记忆力及学习能力等药理活性,具有很高的开发价值。知母主要成分为甾体皂苷,已知的皂苷有AⅠ、AⅡ、AⅢ、AⅣ、BⅠ、BⅡ。皂苷元主要是菝葜皂苷元(Sarsasa-pogenin),且其含量较高,为此作者以知母中菝葜皂苷元为定量检测指标,采用HPLC法测定菝葜皂苷元的含量,并以正交实验优化知母中总皂苷的提取工艺,报道如下。1材料和机器1.1知母、带样、对照品、仪器知母药材粗粉(购于郑州,经河南省中药研究所有关专家鉴定为知母的干燥根茎),菝葜皂苷元对照品(中国生物制品鉴定所提供),甲醇和乙腈(色谱纯),其他化学试剂均为分析纯。1.2p系统、hypersil18柱及超声仪RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);高效液相色谱LC-10ATVP系统(日本SHIMADZU公司),HypersilC18柱(2.5μm,4.6mm×200mm)(大连依利特科学仪器有限公司),AS2060超声仪(AUTOSCIENCE);数显恒温水浴锅HH-4(国华电器有限公司)。2方法和结果2.1母总皂苷的提取精密称取知母干燥粗粉适量,置索氏提取器中,加适当体积分数的乙醇数倍,于100℃水浴中回流提取数小时,浓缩至约50mL,用石油醚萃取3次(首次20mL,以后10mL/次)脱脂,再用正丁醇萃取4次(首次20mL,以后10mL/次),合并正丁醇液,挥干得知母总皂苷。2.2-关于枣林素含量的测定2.2.1皂苷元的测定在按2.1提取得到的知母总皂苷中加入适量含2mol/L盐酸、体积分数为25%的乙醇,再加入一定量的苯于100℃水浴中回流水解3h,冷至室温,分出苯层,酸层再用苯萃取4次(首次40mL,以后30mL/次),合并萃取液,挥干,用甲醇溶解并定容至25mL,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液10mL置蒸发皿中,蒸干,残渣用甲醇溶解并定容到2mL,作为供试液,用微孔滤膜过滤后,精密吸取续滤液10μL,用高效液相色谱法测定菝葜皂苷元的含量。2.2.2流动相rid-10aHypersilC18柱(2.5μm,4.6mm×200mm)。流动相,含体积分数为5%水的乙腈。RID-10A检测器,流速为1.0mL/min,柱温为25℃。在该色谱条件下,菝葜皂苷元可完全分离。2.2.3标准曲线进样,测定峰面积,加标标准曲线进样,线性回归标准。根据以下简称,对于进样标准曲线,分精密称取菝葜皂苷元对照品10.00mg,用甲醇溶解并定容至5mL,然后稀释成每mL含菝葜皂苷元0.10mg,0.30mg,0.50mg,0.70mg,0.90mg和1.10mg的系列标准溶液,按2.2.2所述色谱条件进样,每次10μL,测定其峰面积,将峰面积与浓度进行线性回归。结果表明菝葜皂苷元的甲醇溶液在0.10～1.10g/L范围内线性关系良好,回归方程为A=99839C+903(r=0.9998)。2.2.4进样次数和峰面积按供试品的制备方法制备供试品溶液1份,按2.2.2所述色谱条件进样,每次10μL,连续进样6次,峰面积的均值为118868.81±249.03,RSD为2.10%;于不同时间进样,则样品含量的均值为1.08±0.04,RSD为3.39%。2.2.5加样回收率和rsd精密称取知母干燥粗粉7份,按供试品的制备方法制备供试品溶液7份,按2.2.2所述色谱条件进样,每次10μL,回收率为(98.00±3.43)%,RSD为3.62%。2.3皂苷元含量测定按正交设计表L9(33)安排实验,计算菝葜皂苷元含量。结果见表2。由表2可知最佳提取条件为A1B1C1,即:体积分数为50%乙醇、固液比1:10、提取时间4h。3有机溶剂萃取对皂苷元含量的影响作者于正交实验前进行了预实验,考察了提取方法对知母中总皂苷提取率和菝葜皂苷元含量的影响,结果表明索氏提取法较乙醇回流提取法提取效果好,故本研究中采用索氏提取法。在进行菝葜皂苷元的含量测定时,考察了水解工艺如萃取试剂,萃取次数及水解时加入萃取试剂(保护剂)等因素对菝葜皂苷元含量的影响,结果表明用苯作萃取剂,萃取4次,并在水解时加入苯可明显提高供试液中菝葜皂苷元的含量。中国药典(2005版)采用的分析方法中用NaOH调pH后蒸干药液,用溶剂溶解,由于蒸干后盐类物质较多,难以用有机溶剂完全溶解,故所测样品含量较低,难以完全反映知母中皂苷元的含量;本研究中作者用有机溶剂萃取水解的皂苷元,并对知母总皂苷提取条件进行优选,采用高效液相色谱法对水解产物中的菝葜皂苷元进行定量分析,所测样品含量高,能较完全