血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候血浆蛋白质表达谱研究

血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候血浆蛋白质表达谱研究

作为蛋白质组学的一个分支，血浆蛋白质组学是科学研究血浆中所有蛋白质的组成、在特定条件下的表达以及它们之间的关系的科学科学。人类血浆蛋白有以下几个特点:(1)数量最多,(2)来源广,(3)含量差别非常大,可至10个数量级,(4)是所有组织或细胞中与mRNA表达水平相差最远的蛋白质。而且血浆取材容易、应用广泛,这些蛋白成分在不同的疾病状态下其丰度和结构发生不同的变化。因此,在整体水平上研究血浆蛋白质的表达水平、翻译后修饰、相互作用等,并由此在血浆蛋白水平上获得疾病过程和药物干预过程的外在、综合的认识,在医学基础和应用研究中都有着重要意义。应用蛋白质组学的方法,按照病证结合模式,全面研究血浆中蛋白质表达谱的变化规律,有望从整体上揭示某一疾病的不同中医证候在特定时空条件下的特异性和变化规律。大量的研究报道了血脂异常或动脉粥样硬化或冠心病不同痰瘀证候的患者,在全身众多系统中,诸如脂蛋白、凝血-纤溶系统、免疫系统等,其蛋白质存在着数量和某些结构上的显著差异。因此,我们推测血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候在蛋白质组水平上存在某些功能蛋白表达量的显著差异性,及其相互关系间的某些标志性蛋白种类上的兼容性和由痰致瘀过程中存在某些关键蛋白的结构性或功能性变化的特点。本研究以血脂异常及动脉粥样硬化痰瘀证候临床患者为研究对象,采用二维凝胶电泳技术(two-dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis,2-DE),寻找不同痰瘀证候可能的特异性标志蛋白群,为中医证候临床诊断以及治疗提供客观依据。材料和方法1材料表面1.1不同缓冲液及二硫苏糖醇缓冲液的合成固相pH梯度干胶条(pH3-10,18cm),IPG缓冲液均为GE公司产品,二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、CHAPS均为上海生工产品。1.2凝胶质谱仪检测高速离心机(德国Beckman公司)、EttanIPGphorⅡ等电聚焦仪(GE公司)、EttanDaltsix垂直板电泳槽(GE公司),电泳仪(EPS1001)、labscan凝胶图像扫描仪、Imagemaster6.0凝胶分析软件和Q-TOF质谱仪。2动脉联压药患者年龄分布病例收集自2004年5月—2005年8月在中国中医科学院广安门医院和西苑医院心内科住院确诊的血脂异常及用左侧颈动脉超声诊断确定的动脉粥样硬化患者146例,其中,痰瘀互阻证41例,痰证32例,血瘀证38例,非痰非瘀类证候35例,年龄为35～55岁,平均年龄45岁,另选年龄匹配的健康人37名。所有入选病例于清晨空腹抽取静脉血4.0mL(EDTA抗凝),30min内离心(3500r/min,15min),分离血浆,分装后-80℃储存备用。3方法3.1sds-管定电泳采用IPGphorⅡ聚焦系统进行第一向等电聚焦。取20μL血浆样品与300μL重胀液混合,将pH3-10,18cm非线性IPG胶条重胀,12h后,聚焦24h,梯度升压至8000V。聚焦结束后,IPG胶条在含1%的DTT和2.5%的IAM10mL平衡液中进行二步平衡。平衡好的IPG胶条转入预制好的15%聚丙烯酰胺凝胶板上部,进行第二向SDS电泳。分析胶采用考马斯亮蓝染色(按Neuhoff胶体考马斯亮蓝G-250的方法进行)后,采用Labscan凝胶图像扫描仪进行扫描。3.2血浆2-de图谱采用Imagemaster6.0图像分析软件对血浆2-DE图谱进行差异分析,比较蛋白斑点的数量及蛋白表达量,获取不同证候的差异蛋白质表达谱及其在不同痰瘀证候间传变的变化规律。3.3苯基碳酸盐系对甲基碳酸氢铵稳定性的影响切取确定的差异蛋白质斑点,置于1.5mLEp管中,用含50%乙腈和2mmol/L碳酸氢铵溶液脱色,胶片真空离心干燥后,加入4μL胰酶,37℃保温18h,再加入5%三氟乙酸12μL,40℃保温1h,吸出上清,加入含2.5%三氟乙酸的50%乙腈溶液120μL于30℃保温1h,合并上清液冷冻干燥。3.4q-tof-ms分析用5μL三氟乙酸溶解样品。取1μL样品点靶,另取1μLα-腈基-4-羟基肉桂酸溶于0.1%三氟乙酸/50%乙腈的饱和溶液作基质,室温干燥后,于Q-TOF-MS质谱仪上进行质谱分析。质谱峰采用Bruker的肽段标准或胰酶的自切峰进行标定。3.5数据库中的蛋白质研究3.6-de图谱分析与标志蛋白群筛选采用Fisher典型性分析方法,对由2-DE图谱分析获得的不同证候差异蛋白质表达谱进行组间典型成分的判别分析,筛选出具有显著区分功能的标志蛋白质群。差异表达蛋白的部位及浓度变化1血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候血浆蛋白质组差异表达谱(表1)对血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候患者的血浆蛋白2-DE扫描图谱,利用GE公司Imagemaster6.0凝胶分析软件进行分析,显示可识别的蛋白质斑点平均为600左右。对组间匹配变异度在70%以上的31个差异表达蛋白质斑点,经二级质谱鉴定后,通过网上蛋白质数据库比对。由于某些蛋白质(如白蛋白、载脂蛋白AI前体)可能具有不同的修饰状态或功能片段,而在2-DE图上有不同的位置,因此除2个斑点未能确定外,其余共发现了以下15种不同的蛋白质:α-1B-糖蛋白前体,血红蛋白结合蛋白前体,免疫球蛋白,α-1抗胰蛋白酶片段,白蛋白,结合珠蛋白,纤维蛋白原γ链,α-2糖化锌蛋白前体,簇连蛋白前体,载脂蛋白AI前体,结合珠蛋白前体,纤维蛋白原γ链前体,肾上腺髓质素结合蛋白前体,载脂蛋白AI前体,补体C4。其中变异度超过100%的11个差异表达斑点中除2个未确定外,其余9个斑点确定为7种不同的蛋白质,分别是:纤维蛋白原β链、白蛋白,纤维蛋白原γ链,结合珠蛋白前体,肾上腺髓质素结合蛋白前体,载脂蛋白AI前体,补体C4。表1所示为上述17种差异表达蛋白在不同痰瘀证侯中的分布及其表达差异。2表达差异蛋白在血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候间的变化规律(表2)进一步分析上述差异表达蛋白在不同痰瘀证候中的表达量变化,发现它们随证候间的不同传变方式具有不同的递增或递减的规律性变化。随痰证向痰瘀互阻证至血瘀证变化的蛋白质共有8个(其中2个未能鉴定),其中3个表达量逐渐升高,5个表达量逐渐降低;而随痰证向血瘀证至痰瘀互阻证变化的蛋白质共有10个,其中表达量逐步升高的4个,逐步降低的有6个;随非痰非瘀类证候向痰证至痰瘀互阻证变化的蛋白质共12个,其中表达量逐渐升高的5个,逐渐降低的有7个;随非痰非瘀类证候向血瘀证至痰瘀互阻证变化的蛋白质共有8个,其中表达量逐步升高的有5个,逐步降低的有3个,随非痰非瘀类证候向痰证至痰瘀互阻证变化的蛋白质共10个,表达量逐步升高或降低的各有5个。3表达差异蛋白的证候特异性组合(表3)采用Fisher判别法对其中变异度在100%以上的9个差异蛋白(包括2种未鉴定的蛋白)进行分析,获得了其中7种蛋白质具有可显著区分血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候功能的可能的标志蛋白群,其中除结合珠蛋白前体表达量较正常人群下调外,其余6种蛋白质均有明显上调。可区分血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候的标志蛋白群在组合上可因相互关系不同而有较大差异,同时在不同痰瘀证候间也存在某些功能蛋白相互兼容的情况。高血压与动脉社会蛋白药物代谢的相关性血脂异常属中医痰浊范畴,血脂和脂蛋白代谢紊乱是血中痰浊的生化物质基础。而将血小板活化、血栓形成、内皮损伤、粥样斑块等归结为“血瘀”。证候是通过四诊(即望、闻、问、切)手段获得的机体在特定时空条件下对各种内外因素(包括机体生理功能及生物、化学、环境、精神、气候等各种致病因子)反应而呈现的生理、病理状态信息综合判断结果的表述。因此,证候也是机体对内外因素的整体性反应状态。证候的发生和变化受多种因素的共同影响并随个体和时空而变化。证候的多样性和蛋白质组表达差异性都是机体即时性功能状态反应的结果,这种共性特征为证候切入蛋白质组学研究提供了重要的理论依据。本文应用蛋白质组学方法,对血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候患者的血浆蛋白质表达谱进行了研究,获得了可以相互区分痰证、瘀证、痰瘀互阻证以及非痰非瘀类证候可能的标志蛋白群。这一结果为我们提出的“不同证候之间在蛋白质组水平上存在某些功能蛋白表达量的显著差异性,其相互关系间的某些标志性蛋白种类上的兼容性和由痰致瘀过程中存在某些关键蛋白的结构性或功能性变化的特点”及“证候的特异性以及证候病因病机的生物学基础是不同分子在特定时空条件下的特定组合”的理论假说提供了实验证据,也可能为高脂血症及动脉粥样硬化不同痰瘀证候的微观诊断、治疗及预后等提供客观依据,但对此可能需要根据不同情况进行具体分析。资料表明,研究结果所发现的这些标志蛋白质与高脂血症及动脉粥样硬化的发生和发展有着密切的关系。如纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)已知是心血管病的一个独立的危险因素。在动脉粥样硬化形成早期,它与低密度脂蛋白一起侵入动脉壁,它可直接损伤血管内皮细胞的抗凝和纤溶活性。作为炎性反应因子不仅在动脉粥样硬化的免疫炎症反应中起作用,并可促进细胞黏附及平滑肌细胞迁移和增值等。与纤维蛋白原一样,差异表达蛋白α1-抗胰蛋白酶和血红蛋白结合蛋白都属于炎症敏感的血浆蛋白(inflammation-sensitiveplasmaproteins,ISP)。这些蛋白水平增高也与高胆固醇水平密切相关。白蛋白为血浆转运蛋白,参与脂肪酸运输。研究报道糖基化白蛋白可加速动脉粥样硬化,它可引起激活血管壁氧化压力;增进对S100A8/A9的前炎症内皮反应和促进血管内皮细胞的增殖和迁移。本项研究结果中的白蛋白是否是糖基化未能进一步的确定。但从2-DE上看肯定不是正常的白蛋白,而是经过某种修饰的白蛋白。结果显示的3个不同ID的白蛋白,可能表示有着不同的修饰,尚待进一步确定。血浆补体C3和C4水平与血脂水平显著相关,在原发性的高胆固醇血症中伴有明显的补体C3和C4水平增高。apoAI是HDL的主要载脂蛋白,它和HDL有直接的抗动脉粥样硬化和血管保护作用。apoAI表达增多能增加HDL-胆固醇水平,明显减轻动脉粥样硬化。血红蛋白结合蛋白与apoAI有高的亲和力,它分布在乳糜颗粒和HDL中,参与脂代谢调节。通过对痰瘀证候间的相互关系及变化规律分析,发现绝大部分差异表达蛋白质都随着由非痰