毛白杜鹃组培再生植株的耐碱筛选

毛白杜鹃组培再生植株的耐碱筛选

杜鹃花是世界著名的花，也是中国四大花之一。杜鹃对土壤的ph值有很高的要求。它们中的大多数是典型的酸性指状植物，它们容易被碱化，叶片会枯萎、枯萎和掉落，导致整个植物的死亡。由于自然界对耐碱杜鹃的资源缺乏了解，因此很难通过传统的混合育种方法获得耐碱品种。此外，由于目前不清楚区分杜鹃的耐碱性，因此很难使用互补培养方法。为了在碱性土壤中种植杜鹃，经过多次测试，有用碱性土壤中的一个进行分析，然后知道哪个是公平的。在组织培养过程中，植物细胞在诱导或诱导的细胞间克隆效应是很好的。对这些突变的精确处理将显著提高新品种的产量。根据耐碱试验，hco3-是碱性土壤环境中植物缺铁失绿的主要因素。因此，在本研究中，以红景天为材料，通过naoho3碱性培养环境，在细胞和组织上筛选耐碱突变细胞或分裂芽，以获得稳定的抗碱性突然改变。它为保护杜鹃的耐碱繁殖提供了资源。1材料和方法1.1植物组培训和再生体系的建立1.1.1叶的消毒处理毛白杜鹃幼叶为外植体.首先将含幼叶的嫩枝在空气湿度大于90%的培养室中水培7d左右,每天喷施0.05%多菌灵等杀菌液后,取嫩叶用自来水冲洗,于70%乙醇中浸泡30～60s,再用0.1%HgCl2(含土温-20)消毒10min以上,无菌水冲洗数次,进行接种.1.1.2培养基和试剂以Anderson改良的杜鹃花培养基为基本培养基(以下简称A培养基),pH为5.5～5.6.愈伤组织诱导培养基为,A培养基+4mg/LZT+3mg/L2,4-D;芽诱导培养基为,A培养基+15mg/LZT+5.0mg/LIBA;壮苗培养基为,A培养基+2mg/LZT+1mg/LIAA;生根诱导培养基为,1/4无机盐浓度(不含微量元素I-)的A培养基+0.2mg/LZT+0.5mg/LIBA.培养条件为(25±1)℃,每天光照12h,光强为1500～2000lx.1.1.3集体苗移植待组培苗生根后,除去封膜、敞开瓶口3～5d,然后将组培苗转移到水培液中培养2周,再移栽入土.1.2耐碱筛选培养基在超净工作台上,将过滤灭菌的NaHCO3溶液加入高温灭菌的芽诱导培养基中,以0、2、4、6、8、10、12、14mmol/L等8种不同浓度形成的pH值分别为5.00、6.67、7.04、7.44、7.76、8.02、8.24和8.40的耐碱筛选培养基.1.3材料的筛选和再生植株的筛选将多次继代仍具高分化率的不定芽丛切成小块转入上述耐碱筛选培养基中.同一处理设5个培养皿.每个培养皿中接25块材料,每一小块含不定芽5个以上.3个月后,将在碱环境中筛选出的存活芽丛交替接种在正常(不含NaHCO3)和保留原筛选条件的2种培养环境中,进行扩增培养(剔除嗜性细胞)和重复筛选.重复多次后将筛选出的存活芽丛进行扩增、壮苗和生根诱导,从中获得再生植株.1.4水培营养液的制备将耐碱筛选获得的耐碱杜鹃再生植株和正常环境下继代杜鹃再生植株(对照)同时转入以下2种碱性环境中培养:①在含10mmol/LNaHCO3的水培营养液(大量元素为完全营养液的1/2,pH8.0)中培养10d,培养容器为500mL瓷缸,每缸8株,温度(25±1)℃,光照52μmolm-2s-1,连续通气;②栽培于蛭石基质中,以自来水(pH7.4)持续浇灌.前者参照Bienfait等和许良政等的方法,分别于第2、4、6、9、10天分析其根系Fe3+还原酶活性变化;后者参照张志良的方法,分别于第0、15、30、45、60天测定叶绿素含量变化.2结果与分析2.1丛生芽的死亡情况将丛生芽在筛选培养基中培养一段时间以后,观察发现:在4mmol/L以下,NaHCO3浓度对丛生芽生长影响较小.随着NaHCO3浓度从6mmol/L增加到14mmol/L,丛生芽的褐/黄化程度越来越严重,死亡速度也越来越快.近1个月时,含14mmol/LNaHCO3的培养基上的丛生芽全部死亡;近2个月时,含12mmol/LNaHCO3的培养基上的丛生芽全部死亡;近3个月时,含10mmol/LNaHCO3的培养基上的丛生芽存活10%,含8mmol/L的存活约50%.由于10mmol/LNaHCO3处理的存活丛生芽在进一步的培养中不再全部死亡,且有1/2左右保持绿色,并有所生长和增殖,因此认为10mmol/LNaHCO3是耐碱突变体筛选的适宜选择压.将经10mmol/LNaHCO33个月耐碱筛选获得的丛芽转接到不加NaHCO3正常增殖的培养基中进行2个月的增殖壮苗培养,然后转接到含10mmol/LNaHCO3的培养基中,重复筛选3个月.虽然在筛选培养基中耐碱芽生长较缓慢,所得的苗有些纤弱,但我们认为,这些绿色丛芽具有更稳定的耐碱性.2.2耐碱突变体的生理生化特性水培和基质盆栽试验均表明,筛选获得的耐碱突变体对NaHCO3形成的高pH值环境和碱性自来水浇灌有较强的适应性,而对照材料对培养环境很敏感.对照在水培条件下5d以后大部分严重黄花,出现失绿的症状,10～15d后小苗陆续死亡;而耐碱突变体在培养期(15d)内黄化现象较轻,没有失绿和死苗现象,生长较好.栽培条件下碱性自来水浇灌后的表现与水培条件下的情况基本类似,只是变化进程有所延长.为了验证这些耐碱突变体表现的内在生理生化机理及其稳定性,我们分析了NaHCO3形成的高pH值水培条件下根系Fe+3还原酶活性的变化和基质栽培条件下碱性自来水浇灌对叶片叶绿素含量的影响.结果表明:在培养10d后,耐碱突变体的根系Fe+3还原酶活性仍保持高水平(38.4μmol/g·2h),比最高值(培养第6天,42.5μmol/g·2h)略有降低;而在第10天,对照的根系Fe+3还原酶活性(17.0μmol/g·2h)则比最高值(40.7μmol/g·2h)降低了58%以上(见图1).同样,栽培条件下耐碱突变体新鲜叶片中叶绿素含量下降缓慢,从开始的385mg·g-1到第60天的256mg·g-1,下降了不到34%;而对照却从390mg·g-1降到了78mg·g-1,降低了80%(见图2).3选择耐碱突变体(1)本试验是应用植物细胞工程技术获取耐碱突变体的初步尝试.其根据和前提是:在组织培养和经多次继代以及高2,4-D浓度的情况下,愈伤组织可能出现突变细胞;在高分化率的情况下,有可能发生体细胞无性系变异,进而产生突变芽.截止1990年代初,已经在农作物、果树和观赏植物等的组织培养中观察到了变异突变株,变异率有的可达10%以上.另外,许多抗碱研究表明,在不适于植物生长的碱性(石灰质)土壤环境中,HCO3-是碱性石灰质导致植物缺铁失绿和抑制根系生长的最重要因子之一.在毛白杜鹃组织培养的研究中,我们得到了有较强分裂能力的愈伤组织和经高分化所产生的大量丛生芽,因此利用以NaHCO3形成的碱性环境作为毛白杜鹃耐碱变异细胞或组织、器官的筛选压力.(2)以大量细小的丛生芽为筛选对象,可以使所获得的耐碱突变体直接进行增殖,从而解决经逆境处理的组织很难再生的问题,并且在整体水平上小芽对碱性环境作出反应更具有直观性和稳定性.(3)本试验的结果表明:经碱性培养基筛选所得的耐碱突变体对碱性环境的耐受力有较大的提高,表现在其叶绿素降低的速度得到了延缓;也表现在其根系对碱性环境的适应性大为提高(根系F