代谢组学视角下中医证候研究的新突破

代谢组学视角下中医证候研究的新突破

中医证候是中医整体观和辨证论治观的体现。中医证候的研究是中医基础研究的一个重要科学问题。作为系统生物学的代谢组学是多层次、多靶点研究表达集体的功能状态,以及通过代谢轮廓代谢指纹的变化表达外源性扰动带来的功能改变,其无歧视的整体性、动态的功能性,与中医证候对病理状态的整体表述的理念相吻合,引入代谢组学的理念和方法,不仅有助于探索中医证候的本质,更有益于推进基于证候的中药创新药物的研究。本文综述了近年来中医证候的研究和基于代谢组学的中医证候本质研究的相关文献,以期对证候研究及中医药的相关研究有所帮助。一、中医证候辨证标准的建立和完善为中医证候是中医关于人体在疾病状态下信息的综合征象,是对人体在疾病发生、发展过程中某一时段生理、病理状态的概括,是中医学辨证论治的基础。中医认为“视其外应,以知其内脏,则知所病矣”、“有诸内必形诸外”,即疾病在体内的病理变化,必定在体表找到其可征之候,出现相应的症状。因此证候是中医辨证论治和整体观的集中体现。近年来中医证候的研究主要包括辨证标准的统一、证候动物模型的建立等有关证候本质的探索工作。目前中医证候辨证标准的建立方法为首先获取辨证信息,然后通过数理统计或专业知识判断等方法建立辨证标准,最后检验辨证标准。证候辨证标准的建立尽管在研究方法上取得了显著进展,但未有实质性突破。单纯应用数理统计方法偏离了中医药理论复杂体系,而用专家判断的方法也没有摆脱统计指标的局限,尽管在一定程度上表述了辨证标准的客观化,并未挖掘出证候的内在信息。中医证候动物模型的建立主要分两个方面:一是根据中医理论病因病机模拟造模;二是由药物(中药或化学药物)直接诱导疾病造模。根据动物的病理表现,结合证的客观指标,加之以方药测证等方法来确定证候造模是否成功。这两种方法都囿于动物不能表述其病理感受,不能通过四诊综合判断证候,证候的内在综合信息又缺少反映的方式和方法,造模是否和证候直接关联难以评价,造模方法的科学性问题尚在探讨之中。以往对于中医证候本质的研究是一直是按照西医的还原论思维方法,从整体到器官、组织、细胞,不断细分到分子生物学,试图找到能够评价证候的生化指标。但是,中医治病与西医拮抗特定的疾病靶点的治疗方法不同,是通过调整机体的整体功能状态,使恢复人体原本的系统平衡状态。中医证候不仅仅是几个症状和体征的简单相加,而且是一组综合的证候群,是对病因、病性、邪正盛衰等疾病本质的集中概括,单纯以还原论方法将其研究不断细化不足以表征证候本质。二、代谢组学的现代发展代谢组学(Metabonomics/Metabolomics)是定量研究有机体对由病理生理刺激或遗传变异引起的、与时间相关的多参数代谢应答,是Nicholson等在长期应用1H-NMR方法研究生物体液、细胞、组织中的多成分代谢的基础上提出的。代谢组学的主要研究对象是小分子的代谢产物,样品主要有尿液、血浆或血清、唾液,以及细胞和组织的提取液。通过对生物体液和组织进行系统测量和分析,对完整的生物体(而不是单个细胞)中随时间改变的代谢物进行动态跟踪检测、定量和分类,并与病理生理过程中的生物化学和生理学改变关联起来,确定发生这些变化的靶器官和作用位点,进而确定相关的生物标志物。目前代谢组学已广泛应用于药物安全性评价、疾病诊断、药效评价等方面。完整的代谢组学分析的流程包括样品的采集和预处理、数据的采集和数据的分析及解释。目前代谢组学的数据采集技术主要有色谱、质谱、核磁共振技术及液-质联用和气质联用技术等。色谱具有高分离度、高通量的特点;质谱有很强的普适性、高灵敏度和特异性;核磁共振技术能够对样品实现非破坏性、非选择性的分析且1H-NMR对含氢代谢产物有普适性,是当前代谢组学研究中的主要技术。但其样品制备的要求高,动态范围有限,很难同时测定生物体系中共存浓度相差较大的代谢产物,所需硬件的投资也较大。而各种谱学技术结合的方法,能够保证尽可能精确地分析生物体系中尽量多的代谢组分,使得整个分析过程尽可能多的保留样品中代谢物的整体信息,是今后代谢组学分析技术发展的必然趋势。数据分析技术主要是利用模式识别对采集的信息进行化学计量学处理,分为监督型和监督型方法,前者有主成分分析(PCA)、非线性映射(NLM)、聚类分析(CA)等,后者包括人工神经网络(ANN)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)等,最终要建立可利用的相关数据库及专家系统,如伦敦大学的皇家科学院实验室和Pfizer等6家制药公司2001年启动的药物毒性研究小组(COMET)初步建立的“CLOUDS”系统。陈竺认为到了系统生物学的时代,强调整体论的中医和强调还原论的西医找到了共同语言。而作为系统生物学重要组成部分的代谢组学应当成为中医药现代化研究的重要技术与方法。刘昌孝认为中医诊治的准确性很大程度上依赖医生的诊疗经验。而代谢组学具备反映和诠释这些问题的“组”、“群”、“谱”集成的分析功能,它能够通过检测不同时间患者的尿液或血液,对这些代谢产物进行分析,可以提高诊治的科学化、定量化,避免人为因素的误诊。利用代谢组学研究中医证候摆脱了西方还原论的束缚,从整体层面分析中医证候的特点,反映中医证候的内涵,高通量及无歧视的成分分析能够快速解决中医证候主观对信息的歧视的问题,使中医证候本质客观化。三、基于代谢研究的中医证候研究1.潜在生物标记物通过建立中医证候的动物模型,分析其生物样本,进行代谢组学研究,找到中医证候的生物标记物,有利于进一步阐明中医证候的本质并应用于临床诊断和治疗。PingWang等利用UPLCHDMS对大鼠肾阴虚证模型进行了代谢组学研究。灌胃给予甲状腺素和利血平造成大鼠肾阴虚证模型,检测尿液代谢轮廓,主成分分析(PCA)发现肾阴虚证组与空白组有显著性差异,并结合正交偏最小二乘判别分析方法(O-PLS-DA)找到20个离子作为肾阴虚证的潜在生物标记物,这些物质与色氨酸、赖氨酸、嘌呤、嘧啶、三羧酸循环等代谢通路有关。给予六味地黄丸后使上述潜在标记物的代谢轮廓回调至正常动物水平。XinjieZhao等用UPLCQ-TOF/MS对大鼠血瘀证模型进行了代谢组学研究。注射肾上腺素盐酸盐、并浸入冰水,致大鼠血瘀证模型。经PCA分析得模型组与空白组尿液代谢轮廓有显著性差异,偏最小二乘法判别分析(PLSDA)分析找到7个可作为血瘀证潜在生物标记物:胆汁酸、二羟基胆烷酸、苯丙氨酸、犬尿喹酸、色氨酸、精氨酸、N-2-琥珀酰-鸟氨酸。推测这些标记物与体内苯丙氨酸、5-羟色氨生物的代谢通路有关,能够影响NO的合成路径进而影响心血管系统的功能。模型组给予不同剂量的新迪软胶囊后,尿液代谢轮廓介于空白组与模型组之间,有回调至空白组水平的趋势,且高中剂量组较低剂量组的代谢轮廓更接近空白组。罗和古等利用1H-NMR对大鼠肝郁脾虚证模型进行了代谢组学研究。用慢性束缚法致大鼠肝郁脾虚证模型后,PCA分析大鼠血浆代谢谱发现了5个可作为肝郁脾虚证的生物标志物,包括醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和3.44ppm的未知化合物。上述内源性代谢物的改变提示动物能量代谢及脂肪、蛋白质代谢功能异常,这与已知的应激态动物体内代谢的调节过程及结果相一致。姜春燕等利用UPLCTOF/MS对大鼠肾阳虚证模型进行了代谢组学研究。臀部肌肉注射糖皮质激素氢化可的松琥珀酸钠造成肾阳虚证模型后,首先观察大鼠行为状态变化,并以血清促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(COR)、环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)为客观指标,且通过灌胃白附片溶液反证3个方面共识确定为肾阳虚证模型。OPLS分析血浆内源性代谢物发现了3个肾阳虚证的生物标记物,分别为溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)和468.4m/z的未知化合物,推测LPE、LPC的改变可能与造模引起的肝损伤有关。张惠云等利用UPLCTOF/MS对大鼠经前期综合征肝气逆证模型进行了代谢组学研究。用电刺激法复制经前期综合征肝气逆证大鼠模型,检测各组大鼠尿液的代谢指纹变化,对照组、造模组得到较好的区分,给予白香丹胶囊后代谢网络有修复趋势。分析表征14个潜在生物标记物,包括甲基鸟嘌呤、2,3-二羟基-3-甲基戊酸、D-半乳糖胺、5-氨基戊酸、2-氨基己二酸、D-脯氨酸、褪黑激素、3羟基丙酮酸-5-羧基、4-羟基谷氨酸、2,3-二氢甲基砒啶酸、去氧腺苷、5,7,4’-三羟基异黄酮、癸二酸、前列腺素F2α。其中2-氨基己二酸、褪黑激素、4-羟基谷氨酸参与了与情绪活动密切相关的代谢途径;5,7,4’-三羟基异黄酮与调节经前期症状关系密切;前列腺素F2α与影响月经周期有关。进行中医证候动物模型的代谢组学研究,有助于探讨中医证候产生的病理机制,对证候动物模型也起客观评价作用。但是建立能够完全体现中医理论和证候特点的动物模型非常困难,并且由于动物与人存在生理差异,研究结果能否应用于临床还值得探讨。2.血浆及中医分型选择临床同一疾病的患者进行辨证分型,进行各个证型的代谢组学研究即同病异证的研究。同病异证是中医证候在同一疾病中的体现,是中西医结合研究的重要环节。目前研究较多的有冠心病、肾病、高血压、糖尿病等。由于这类疾病发病率高、持续时间长、死亡率高,且化学药物治疗效果不好,采用中医药治疗时就需要对患者的症状进行辨证分型,因此中医证候辨证标准亟待建立。而利用代谢组学技术研究中医证候,找到表征其病理状态的生物标记物有助于提高中医药临床治疗效果。XintianZheng等利用GC-MS对冠心病心气虚证和心血瘀证患者血浆中脂肪酸进行了代谢组学研究。选择25例健康者和23例冠心病患者,患者根据症状分为心气虚和心血瘀两个群组。利用模式识别方法分析血浆中脂肪酸代谢轮廓,能够明显区别两种证候,找到的潜在生物标记物有饱和脂肪酸、N-3多不饱和脂肪酸、N-6多不饱和脂肪酸、反式脂肪酸等。推测其作用机制可能为:高浓度的N-6和代低浓度的N-3对心血瘀证和心气虚证有很大影响,可能致动脉粥样硬化,最后致血瘀证候;也可降低心肌耐缺氧能力和心输出量,引起胸闷、心悸、气短、和心气虚证的体力不支症状。董飞侠等利用GC-MS对慢性肾病Ⅲ期患者尿液进行了代谢组学研究。选择慢性肾病Ⅲ期患者60例(其中肾阳虚者30例,非肾阳虚者30例)及体检健康志愿者30例,经PCA和OPLS-DA分析能够很好区分肾阳虚和非肾阳虚两组病人,差异代谢物的关键成分是丙氨酸、胺基丙二酸二乙酯、脯氨酸、柠檬酸、马尿酸和组胺等,这些成分与能量代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,组氨酸代谢途径相关。王广基等利用GC-TOF/MS对冠心病中医分型进行了代谢组学研究。选择43例冠心病患者分为痰阻心脉证(29例)和气阴两虚证(14例),健康志愿者27例作为对照组。分析发现痰阻心脉患者血浆软脂酸、脯氨酸、门冬氨酸、油酸、谷氨酸、苯丙氨酸和尿酸显著高于健康对照组;而次黄嘌呤和4-羟基苯甲酸显著低于健康对照组。气阴两虚患者血浆琥珀酸、门冬氨酸、3-羟基丁酸、油酸、软脂酸、硬脂酸、脯氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸显著高于健康对照组;而天(门)冬酰胺、色氨酸、次黄嘌呤和4-羟基苯甲酸显著低于健康对照组。两证型间多个内源性代谢物的含量存在明显差异并与能量代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢异常相关。利用临床同病异证进行代谢组学研究,避免了动物模型与人体生理病理状态的差异,研究结果可以直接应用于临床实践。三、高血压的治疗目前代谢组学在中医药研究中应用日趋广泛而深入,但代谢组学研究自身具有复杂性,且整体上仍处于发展阶段,受到个体差异、内外源性物质扰动与数据挖掘及信息处理技术的局限。如陆益红等将原发性高血压患者辨证分为肝火亢盛、痰湿壅盛及阴虚阳亢三型,应用GC/MS测定健康人及患者血清内源性代谢物,分析表明利用PCA和PLS—DA不能将高血压的3个证型完全分开,而马氏距离分析(MD)不仅可以清晰地区分上述3种类型的高血压,同时还显示高血压的发展过程。高岗等进行了肾虚证代谢组学及六味地黄汤的干预研究。他们分别应用NMR,LC-MSn,LC-TOF/MS,GC-MS对大鼠尿液和血浆样品进行分析,结果显示用不同分析方法找到的标记物不相同。说明单纯用一种分析仪器或方法,只能给出代谢产物的部分信息,因此结合多种分析和技术进行代谢组学研究是必要