i型胶原与脂肪干细胞的生物相容性研究

i型胶原与脂肪干细胞的生物相容性研究

脂肪干燥能促进血液循环，具有多向分化潜力，对各种组织的损伤有良好的修复效果，而且易于消化。这是组织工程研究中的一个重要种子细胞之一。理想的种植材料应具有良好的生物相容性,对细胞、组织等无毒性。不同材料对细胞的生长、分化和黏附均有不同的影响,因而种子细胞能否在支架材料上良好生长,并表达自身特异性功能是目前组织工程研究的一个热点。本实验首次用人脂肪干细胞与I型胶原支架材料进行体外混合培养,了解支架材料对细胞粘附、生长、增殖等功能的影响,以便寻找适宜的脂肪组织工程细胞载体,为进一步的体内实验提供理论依据。1材料和方法1.1材料和细胞培养板DMEM、特级胎牛血清由Gibco公司生产;I型胶原酶、胰蛋白酶、I型胶原支架材料、四氮唑复合物(XTT),硫酸酚嗪甲酯和二甲基亚砜均购自Sigma,12孔细胞培养板购自Corning。1.2方法1.2.1细胞活性检测取人吸脂术中吸出的脂质部分,用缓冲液反复冲洗,剪刀剪碎。0.1%胶原酶37℃消化40min,期间需反复震荡混匀1次,使用等量体积的完全培养基中和后,离心1300×g5min,去上清,沉淀混悬后使用肽盼蓝染色检测细胞活性,加入10%DMEM培养基中,37℃5%CO2孵箱培养过夜。待细胞生长融合达80%即可传代,取第3~4代细胞供实验用。1.2.2培养液的消毒将胶原蛋白支架材料裁制成10mm×10mm×1mm大小,利用紫外线照射及酒精浸泡消毒,培养液平衡后待用。培养的脂肪干细胞消化后制成细胞悬液,细胞密度为2×105/ml,表面种植0.2ml细胞悬液,静置4h后,加入含20%胎牛血清的DMEM培养液,37℃、5%CO2培养箱中培养。1.2.3独立显微镜观察1.2.4kasen报道的方法用于确定细胞的依赖度1.2.5加材料空白对照组将胶原支架材料7块(5mm×5mm×1mm)分别置于96孔培养板中,并设7孔为不加材料的空白对照组,各4个复孔。将ADSCS以1×104/孔接种于材料及空白孔,置37℃5%CO2孵箱培养3、5、7d,以主波长450nm,参比波长630nm在酶标仪上比色,测定吸光度A值。1.2.6扫描电子观察1.2.7统计处理2结果2.1培养时间和支架对细胞毒性的影响刚接种的细胞呈圆形,在支架材料内均匀分布;透光性差,24h内细胞伸展、黏附,透光性增加,不易观测。2~3d已完全伸展变形,以三角形和梭形为主,呈网状排列;随着培养时间的延长,支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形,种植7d后,细胞数量明显增加,极少细胞从支架上掉落。表明脂肪干细胞能在支架上良好地附着、生长和增殖(图1)。2.2子粘附率的检测经检测,7块复合材料中,每块细胞黏附率均达95%以上,平均达97.9%,说明该支架对细胞有良好的黏附性。2.3细胞接种后细胞活性检测从活细胞吸光度所绘制的细胞增殖柱形图来看(图2),细胞接种后,实验组和空白组随时间延长细胞活性逐渐增加,仍可保持正常的分裂增殖速度,两组之间组相比未见显著性差异(P>0.05)。2.4表面拉伸、黏附细胞种植3d后,细胞呈扁平多角形或圆形,在材料表面伸展、黏附;种植1周后,形态为梭形或圆形,细胞数量明显增多,呈聚集性分布,细胞周围有大量基质,表明脂肪干细胞在支架上粘附、伸展和生长良好(图3)。3细胞活性成分的检测胶原蛋白是目前组织工程学研究中最常用的天然生物材料,由多种糖蛋白分子组成,占机体总蛋白的30%(85%为I型胶原蛋白),它具有多方面的生物活性,不仅是组织支持物,而且是细胞外间质的重要成分。研究表明,胶原蛋白生物相容性好,降解速度可调,而且可参与组织修复,是一类优良的可引导组织再生的生物材料。Ⅰ型胶原作为体外细胞培养支架时,有促进细胞粘附和诱导生长分化的作用,是良好的培养粘附剂。其降解产物可被细胞利用合成新的基质。不产生毒性代谢产物,不影响内环境pH值,因此不会影响细胞的生长增殖。胶原蛋白及相关制品已广泛应用于临床医学中,已被美国FDA批准作为人工皮肤材料。本研究利用人脂肪干细胞作为种子细胞,进行体外细胞种植胶原支架,通过倒置显微镜和电镜观察细胞伸展、黏附和生长过程。镜下显示,种子细胞种植胶原材料后,生长状态良好,无明显细胞毒性表现,在培养条件相对稳定的情况下,细胞可以进行正常增殖、迁移并分泌细胞外基质。通过检测,细胞与支架的黏附率达97%以上,说明该支架对细胞有良好的亲和性。XTT法常用于体外细胞增殖和药敏检测,通过测定活细胞光吸收值,间接反映活细胞数量。本实验中,细胞支架培养复合培养后,材料接种组细胞的增殖未受到不良影响,说明I型胶原支架对人脂肪干细胞无毒性作用。本实验表明,人脂肪干细胞能在I型胶原支架材料上良好的附着、生长、增殖并在三维支架材料内保持均匀分布。I型胶原支架材料与人脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性,可作为构建脂肪组织工程的细胞载体。细胞接种支架后,动态观察细胞在支架上粘附、伸展、生长、分裂情况。根据Kasten报道的方法做了部分改进。取24孔培养板,在孔内植入备用的胶原蛋白支架材料7块,大小约10mm×10mm×1mm。将细胞浓度为2×105/ml的细胞悬液0.2ml滴加到材料上,静置4h后,置于孵育箱中复合培养4h,换于另一平皿,加入培养液,将原平皿中细胞消化收集,计数仪计数,得出流失的细胞数;细胞材料复合物培养24h后,在培养液中轻轻晃动,换于另一平皿,重复上述步骤,得出未黏附细胞数。粘附率=(接种细胞数-流失细胞数-未粘附细胞数)/