下丘脑室旁核胃动素与胃运动调节

下丘脑室旁核胃动素与胃运动调节

胃动素是一种含有22个氨基酸的多媒体矩阵，主要从肠道顶部的嗜铬细胞（ec2）排出，并在消化间转化。根据文献，腹部胃运动的恶化与血浆中胃动素浓度的变化规律一致。血浆胃素浓度的变化与各种因素有关。其中之一是十二指肠腔的ph值。根据研究，一些部落的人和猪通过磺酸脱水产生胃动素。近年来有文献报道,除消化道外,胃动素还广泛存在于中枢神经系统内,包括大脑皮层、下丘脑、小脑、垂体及松果体,但对于中枢胃动素参与的作用及其机制尚未明了。本工作旨在探讨下丘脑室旁核内胃动素神经元的存在和外源性胃动素注入室旁核对胃运动的影响及其机制。1材料和方法1.1胃动素免疫阳性细胞的免疫组织化学染色1.1.1动物实验前饮食实验选用Wistar大鼠20只,雌雄兼备,体重200～300g,随机分为四组,每组5只:正常饮食组(对照组)、饥饿组、灌酸组、及手术对照组。正常饮食组实验前正常饮食,不作任何处理;饥饿组大鼠实验前禁食18～24h,自由饮水;灌酸组动物实验前自由饮食,在胃十二指肠连接处将一直径2mm管插入十二指肠(远端结扎),灌入0.1N盐酸1ml,保留5min后断头取脑;手术对照组实验前自由饮食,在胃十二指肠连接处将一直径2mm管插入十二指肠(远端结扎),灌入生理盐水1ml,保留5min后断头取脑。1.1.2中性红在pbs和abc染色法四组动物断头取脑后,所需脑段(前囟至前囟后3mm)入4%多聚甲醛固定2h,PBS冲洗组织,20%蔗糖浸泡过夜(4℃)。作额状面连续冰冻切片,厚15μm,用ABC染色法显示,中性红轻度复染,阴性对照以PBS代替第一抗体,其余步骤相同。(所用胃动素抗体由比利时安特卫普大学Timmermans教授提供。)1.1.3每隔麻黄取张数。每隔张数每只大鼠取5张切片计数室旁核胃动素神经元阳性细胞数(每隔四张取一张)。每张切片在室旁核阳性细胞密集处观察4个互不重叠的高倍镜视野计数阳性细胞,4个视野阳性细胞数总和为该切片室旁核的阳性细胞数。1.2动物脑段内甲醛微核试验实验选用Wistar大鼠8只,雌雄兼备,体重200～300g。8%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后,固定在脑立体定位仪上,参照Paxinos-Waston图谱,迷走背核的坐标为:A12.8mm,R0.9mm,H8.1mm,用尖端内径50μm的微玻管缓慢注入30%HRP(购自PromegoRZ>3.0)溶液0.2μl,动物存活40～48h后,经左心室-升主动脉插管,先快速灌注生理盐水50ml,随后慢灌注500ml4%甲醛,切取相关脑段(前囟至前囟后3mm)置入4%甲醛固定2h,20%蔗糖浸泡12～24h(4℃)。冰冻切片40μm,按Mesulam的TMB呈色反应。用1%中性红染液复染。明暗视野显微镜(BX-50,OLYMPUS)下观察。1.3大鼠胃运动的记录1.3.1术后观察及实验分组实验用Wistar大鼠34只,雌雄兼备,体重200～300g。手术前禁食18～24h,自由饮水,8%水合氯醛(400mg/kg)麻醉,将记录胃平滑肌收缩运动的自制应力传感器缝在距幽门十二指肠连接处0.5cm处的胃窦浆膜上,导线通过颈背部伸出。将大鼠头部固定在脑立体定位仪上,按照Paxinos-Waston图谱室旁核坐标为:A1.8mm,R0.5mm,H8mm。将直径2mm的外套管植入,以502胶和牙托粉固定,外套管中植入内芯,防止堵塞。术后每天腹腔给予青霉素钠2万单位以预防感染。术后3d可进行实验。记录前动物禁食18～24h,自由饮水,给药前先观察60min胃运动,待记录平稳后,室旁核微量注射胃动素0.37nmol/L(n=8)、或CCK-80.043nmol/L(n=6)(左或右侧),注射量为0.5μl,观察胃运动频率和幅度的变化。对照组注射生理盐水。(胃动素由比利时鲁汶大学胃肠激素研究室Peeters教授提供;CCK由美国匹兹堡大学Verbalis教授提供)行膈下迷走神经切断术的动物(n=12),术后5d进行实验。实验组(n=6)微量注射胃动素,对照组(n=6)注射生理盐水,注射量及记录时间均与前述迷走神经完整组一致。实验结束后,动物经心脏以生理盐水和4%甲醛灌注固定脑部,作50μm系列冠状切片,观察脑内套管轨迹,确定注射位置是否准确。1.3.2计算结果统计计算给药后胃收缩波频率及振幅指数(单位时间内收缩波振幅总和)较给药前收缩波频率及振幅指数的变化百分数,计算公式为:1.4统计处理实验结果均以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,组间差异显著性采用t检验方法。2结果2.1免疫组化检测在正常对照组下丘脑的室旁核、视上核、弓状核、腹外侧核、腹内侧核等区域均发现有胃动素免疫阳性细胞,阳性细胞胞浆染色均匀,呈棕黄色,细胞膜上及胞浆内有棕色反应颗粒。饥饿组和灌酸组的室旁核胃动素免疫阳性细胞数明显增多(图1～3),与对照组相比均有显著统计学意义(P<0.01,表1)。2.2hrp标记细胞迷走背核注入0.2μlHRP后40～48h,观察到室旁核有HRP标记细胞,细胞浆内有粗大的呈黑色颗粒的TMB反应产物,标记细胞同侧较多,主要在小细胞部,大细胞部较少(图4)。2.3在室外边缘的辅助下，微注入胃动素可能会影响大鼠的胃运动2.3.1胃收缩频率变化率室旁核注入胃动素可使胃的收缩幅度及频率增大,持续10min(图5)。胃收缩幅度变化率在5min内为25.97%±21.84%(P<0.01);在5～10min内为52.65%±26.04%(P<0.05)。胃收缩频率变化率由于标准差比均数大故改用非参数检验,在5min内T=0,P<0.02;在5～10min内T=3,P<0.05。2.3.2动减弱后胃收缩情况大鼠室旁核注入CCK-8可引起大鼠胃运动减弱,胃收缩幅度降低,持续5min(图5),其变化率为-29.57%±8.1%(P<0.05),频率变化无统计意义。2.3.3室旁核胃动素的影响大鼠行膈下迷走神经切断术,5d后重复3.1实验,结果发现:室旁核胃动素增强胃运动的效应消失,注药后胃运动幅度和幅度的变化率与生理盐水组比均无统计意义(P>0.05)。3室旁核内胃动素为大鼠胃运动调节机制的作用据文献报道,内源性胃动素的释放受神经体液因素的影响,蛙皮素、阿片肽等可促进血浆胃动素浓度的增加,胃动素本身也可使血浆胃动素的浓度增高。Thomas和Jacobowitz在1981年用免疫荧光和免疫组化的方法分别报道了在下丘脑的视前区和终板血管器(OVLT)中有较高浓度的胃动素。近年来发现,侧脑室注入胃动素有增加小鼠摄食和抗焦虑的作用本室的研究工作表明,下丘脑胃动素有增强胃运动的作用,本实验的免疫组化结果显示,下丘脑室旁核内存在胃动素免疫阳性细胞,在机体处于饥饿状态或十二指肠内酸性增高的情况下,核团内胃动素免疫阳性细胞数明显增多,表明下丘脑室旁核内胃动素神经元的活动受来自消化道传入信息的影响。由此推测,下丘脑胃动素可能是参与胃运动调节机制的组成部分。下丘脑是内分泌及植物神经调控中枢,是消化机能传入传出信息的重要转换站。有研究表明,电解毁损室旁核及其周围区对大鼠摄食、饮水有影响,损毁室旁核尾侧后可引起动物过食和肥胖。已证实室旁核除含加压素和催产素神经元外,还含有多种可兴奋或抑制胃运动的多肽,如胆囊收缩素(CCK)、促肾上腺皮质激素释放素(CRH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、神经降压素(NT)等。已知外周血浆胃动素浓度为10-10～10-11mol/L,为了证明室旁核内胃动素可能参与中枢对胃运动的调节作用,我们以生理剂量(3.7×10-11mol/L)的胃动素注入室旁核内,观察到清醒大鼠胃运动明显增强。以往的文献证实,中枢内存在有CCK及其受体并能抑制胃运动,我们的实验也证实,室旁核内CCK具有抑制胃运动的作用。可见下丘脑室旁核是此两类脑肠肽实现其对胃运动兴奋或抑制作用的重要核团。下丘脑与延髓的内脏运动与感觉中枢有密切关系,本实验辣根过氧化物酶逆行追踪工作中观察到,迷走背核内注入HRP后4