热补针刺手法防治慢性约束应激大鼠作用机制研究

热补针刺手法防治慢性约束应激大鼠作用机制研究

随着社会的发展，由人类心理状态和社会文化背景等因素引起的过度精神障碍和适应性差的心身疾病的发病率日益增加。许多研究表明，许多疾病，如心脑血管病、癌症、溃疡和抑郁，与慢性心力衰竭的积累有关。尽管中医学中没有心理应激这一概念,但脏象及七情学说很早就认识到不良的环境或精神刺激与躯体疾病的发生发展有密切的关系,从心理应激的发生机制和脏腑功能特点以及临床治疗而言,中医学的肝是机体调节心理应激反应的核心,任何形式的应激首先影响了机体正常的气机,导致气血津液和脏腑功能失调,阴阳失衡。心理应激反应的主要特征是神经内分泌免疫功能紊乱,肝的生理和病理研究证实,中医学肝的功能与现代医学的神经内分泌免疫网络密切相关。有报道,电针百会、三阴交对慢性应激抑郁模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴影响的研究结果表明,电针能显著降低应激大鼠的血浆皮质酮、促肾上腺皮质激素。但从海马对HPA轴功能的调节方面针刺治疗目前尚未见报道。1材料和方法1.1g动物实验中心购买SD雄性大鼠50只,体重(110±10)g,由上海中医药大学动物实验中心提供。将50只大鼠随机分为正常组、模型1组、地塞米松组、模型2组和热补针刺组,共5组,每组10只。1.2药物、试剂和仪器多聚甲醛,批号为F20000526,中国医药上海化学试剂公司。甲醇,批号为T20020525,中国医药上海化学试剂公司。二甲苯,批号为F20020428,中国医药上海化学试剂公司。无水乙醇,批号为200208330,上海振兴化工厂。磷酸氢二钠,批号为2001.0401,上海新华化工厂。0.9%氯化钠注射液,批号为02012901,上海长征富民药业有限公司。磷酸二氢钠,F20011026,中国医药集团上海化学试剂公司。SABC免疫组化试剂盒,SA2002,博士德生物工程有限公司。地塞米松0.75mg/片,批号020401,上海信谊药业公司。光学显微镜,型号CHC-012,日本Olympus。冰冻切片机,批号AS620Cryotome,华骏医疗器械有限公司。切片机,型号AO820,美国AOCO公司。1.3应激应激模型的建立每日将模型1组、模型2组、地塞米松组和热补针刺组大鼠的双后肢立式固定2h,给予束缚应激刺激,模型1组固定2星期,模型2组固定4星期,其他两组固定3星期,普通饲料,自由饮水,正常组不做任何处理。1.4两组日常治疗参考林文注《实验针灸学实验指导》、《大鼠穴位图谱》及比较解剖学为依据。取足三里、太冲、三阴交,参考郑魁山编著的《针灸集锦》和五版教材《针法灸法学》。热补针刺组在造模的同时每日进行热补针法治疗。术者左手拇指或食指紧按针穴,右手将针进至12mm深,候其气至,左手加重压力,右手拇指向前捻按5s,候针下沉紧,针尖拉着有感应的部位,连续重插轻提10s,拇指再向前连续捻按45s,针尖顶着产生感应的部位守气,使针下持续沉紧,每隔5min行针一次,留针20min,每日1次,共治疗3星期。地塞米松组大鼠束缚应激的同时,将地塞米松用自来水配制成混悬液,0.1mg/mL灌胃。正常组、模型1组、模型2组同样抓取,不做任何处理。1.5麻醉大鼠的确定造模及治疗3星期结束后,25%乌拉坦作腹腔麻醉,注射剂量为0.4mL/100g体重,10~15min后待大鼠麻醉达到一定深度,将其固定于手术台上,剖腹,暴露腹主动脉,用10mL一次性注射器(预先用1:25um肝素湿润)抽取腹主动脉血5mL,立即注入抗凝管中,静置2h后离心(3000×g)15min,分离血浆,分装保存于-70℃低温冰箱,待测。腹主动脉抽完血后,4%多聚甲醛立即灌流大鼠,随机取大鼠脑组织分别以备光镜和免疫组化检测。1.6测试指标1.6.1用显微镜力学观察海瑞组织大鼠脑组织固定成功后,取视交叉至乳头体的脑组织,常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色,光镜观察。1.6.2u3000酸、碱、c、l取视交叉至乳头体的脑组织行冠状连续冰冻切片,片厚30uf06dm;(1)4%多聚甲醛/1×PBS后固定10min,0.1MPBS漂洗3次,每次5min,中度震荡;(2)放入0.5%H2O2室温30min,蒸馏水洗3次,每次5min;(3)放入正常山羊血清封闭液(1:10),室温置20min,甩去多余液体,不洗;加一抗稀释液(1:800),37℃,2h;0.1MPBS洗3次,每次5min,中度震荡;二抗稀释液(1mLPBS液加10uf06dL),37℃,20min;0.1MPBS洗3次,每次5min,中度震荡;加入SABC工作液(1mLPBS加10uf06dL),37℃,20min;0.1MPBS洗4次,每次5min,中度震荡;(4)1mL蒸馏水加A、B、C试剂各一滴,室温显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗涤;(5)梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。光学显微镜下观察,并用IMS细胞图像分析系统分析结果。1.7统计方法用SPSS11.5统计软件,单因素方差分析,数据用表示。2结果2.1小鼠海马锥体细胞的排列光镜下观察结果示,正常组大鼠海马锥体细胞排列规则,细胞核圆而大,核仁清晰(图1);模型1组大鼠,海马锥体细胞排列较规则,CA3区可见较多暗神经元改变和少量核固缩神经元(图2);地塞米松组和模型2组大鼠,海马锥体细胞排列不规则,CA3区可见较多核固缩神经元(图3,图4);热补针刺组大鼠海马锥体细胞排列比较规则,在CA3区核固缩神经元明显减少(图5)。2.2各组均采用crh免疫组化检测2.2.1大鼠外周血压监测正常组大鼠下丘脑室旁核有极少量的CRH阳性神经元(图6);模型1组、地塞米松组和模型2组大鼠与正常组比较,下丘脑室旁核有大量的CRH阳性神经元(图7,图8,图9);热补针刺组大鼠与模型1组、地塞米松组和模型2组比较,下丘脑室旁核CRH阳性神经元明显减少(图10)。2.2.2各组大鼠脑crh免疫图像分析结果见表23应激系统与海马神经元系统的深刻反应应激是指机体受到各种应激原刺激时出现的以交感神经兴奋性增高和下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴过度激活为主的一系列神经内分泌反应,适度的应激刺激对人的健康和功能活动起促进作用,使机体快速适应内外环境的变化,而长期持续的HPA轴功能亢进,导致机体对各种感染性疾病的易感状态,皮质激素分泌增多,造成免疫功能障碍。心理应激作为一种非特异性的致病因素,是社会心理因素损害人类健康的主要原因。早在《内经》就已经提出分属五脏之“五志”,为情志致病奠定了理论基础。《灵枢·口问》:“夫百病之始生也,皆生于风雨寒暑,阴阳喜怒,饮食居处,大惊卒恐,则血气分离,阴阳破败,经络厥绝,脉道不通,阴阳相逆,卫气稽留,经脉虚空,血气不次,乃失其常。”《三因极一病证方论·三因篇》认为:“七情,人之常性”;“情志动而中节,本不致病”,指出情志活动是健康个体的正常生理活动,只有在感受外界刺激后情绪反应过于激烈或持续时间过久,机体因此而产生适应不良,才可能引起疾病的发生。现代医学研究认为,应激是指机体受到各种应激原刺激时出现的以交感-肾上腺髓质(SAM)和下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴过度激活为主的一系列神经内分泌反应。适度的应激刺激对人的健康和功能活动起促进作用,使机体快速适应内外环境的变化,而长期剧烈的应激刺激,可导致机体对各种感染性疾病的易感状态,造成免疫功能障碍。下丘脑室旁核(PVN)释放的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)不仅能启动下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴,而且与蓝斑(LC)-去甲肾上腺素构成所谓的“应激系统”。下丘脑和边缘系统是重要的情绪活动整合中枢,边缘系统海马对下丘脑的情绪活动起抑制性调节作用。下丘脑室旁核(PVN)是HPA轴活动的直接控制部位,广泛分布于脑区的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)与应激反应有关,其中下丘脑室旁核(PVN)分泌的CRH是各种应激反应的主要调节者。应激水平的GC对下丘脑室旁核(PVN)的CRH神经元起负反馈调节作用,这一作用主要由边缘系统的海马介导,海马可能与下丘脑室旁核(PVN)之间通过应激敏感性Glu能神经元有双突触联系,来自海马的传入神经纤维围绕下丘脑室旁核(PVN)与CRH神经元的树突紧密接触,对CRH神经元的活动起抑制性调节作用。在中枢神经系统中,海马是与学习、记忆和情绪行为功能密切相关的重要脑区,也是应激易累及损伤的主要靶区;长期慢性应激能引起一系列中枢神经系统改变,包括海马CA3区锥体神经元树突回缩、海马神经元丢失和成年海马神经元再生障碍。应激水平的GC对海马神经元的损伤主要表现在海马CA3区,CA3区神经元对损伤的易感性是由于缺乏钙结合蛋白所致。随着神经影像学技术的发展,越来越多的证据表明慢性应激可导致脑部结构的改变,包括海马体积的变化,通过核磁共振成像技术(MRI),有研究发现创伤后应激障碍患者的右侧海马体积显著小于正常人,而左侧海马体积也减小,但不具有显著性差异。有报道认为,外源性GC可使海马CA1-CA2区钙结合蛋白表达增加,表明对应激的一种适应性反应,这种反应与高浓度Ca2+缓冲作用有关,而CA3区缺乏这种蛋白的表达,对抗Ca2+内流的作用减弱,所以导致CA3区神经元损伤,说明CA3区神经元易损性与兴奋性氨基酸途径的活化有关。李文迅等报道,通过MRI成像技术,观察电针“百会”、“印堂”穴对慢性应激抑郁模型大鼠脑形态结构的影响,结果表明,从T2加权像上观察到大鼠脑裂扩大现象,模型组和电针组与正常组相比较,中脑水管的横截面积有增加,对T2值的分析结果显示,电针组和正常组的海马区T2值接近,而模型组的海马区T2值与电针组和正常组相比较有增加,其海马区T2值与电针组相比较差异有统计学意义。史榕荇等将40只雄性SD大鼠随机分为正常组、抑郁模型组、电针治疗组和百优解组,通过测定大鼠下丘脑CRF、垂体ACTH、肾上腺、血清CORT含量的变化,结果表明抑郁模型组动物下丘脑CRF,肾上腺、血清CORT含量较正常组有显著升高;电针治疗和百优解均可使抑郁模型组动物下丘脑CRF,肾上腺、血清C0RT含量显著下降,说明电针可明显调整慢性应激模型大鼠HPA轴相关激素的分泌,对慢性应激模型大鼠体重有良性调整作用。传统针刺手法热补针法是烧山火针法简化而来的复式补法之一,临床操作时强调双手的协同作用,尤其强调左手的关闭和右手的向前捻按以及重插轻提作用,并将针尖向病所推努令感传顺畅,使气至病所,从而达到理气,活血化瘀,疏通经络的作用。海马通过对下丘脑室旁核CRH的调节参与HPA轴的负反馈调控。本研究光镜下观察结果表明,束缚应激模型1(2星期)组大鼠海马CA3区锥体细胞排列较规则,有较少的核固缩神经元