生物活性玻璃表面修饰的研究

生物活性玻璃表面修饰的研究

生物活性玻璃（bg）是一种性能良好的硬组织修复材料。它具有良好的生物适应性、生物活性和生物矿化特性，以及良好的力学、生物学性能和骨骼传导性。通常用于骨骼和牙齿科的修复治疗。但如果作为单一的硬组织修复材料,其脆性较大,柔韧性不足,不易依需要加工成特定形状或者多孔结构,使其在目前发展较快的组织工程支架材料上的应用受到限制;而对于天然硬组织如骨组织来说,其组成本身可视为由有机物和无机物组成的复合材料。因此不论从改进BG的脆性、成型性方面,还是从仿生的角度来看,将BG与有机高分子进行复合可以克服单一材料的缺点,获得较好的韧性、强度、加工性等。但无机相的BG与高分子复合时二者相容性较差、难以分散均匀,影响到复合材料的界面性能。硅烷偶联剂能显著改善无机粉体与高分子材料的界面相容性。本文中利用BG表面丰富的活泼硅羟基,将氨丙基三乙氧基硅烷[APTES,NH2(CH2)3Si(OC2H5)3]键连到BG表面,以期改善与高分子相的亲和性。前期研究结果表明,将这种经修饰的BG与壳聚糖-明胶复合后,所得到的复合支架的力学性能高于未经修饰的复合支架,表明BG和高分子相间的亲和性得到改善,提高了复合支架的界面性能,本研究中对修饰前后BG的结构进行了表征。而作为组织修复用生物医用材料,必须具有良好的细胞相容性,本文中对修饰后BG的细胞相容性进行了初步研究。1试剂与仪器正硅酸乙酯(天津化学试剂一厂),化学纯;磷酸三乙酯(中国五联化工厂),分析纯;四水合硝酸钙(广州化学试剂厂),分析纯;盐酸(广东省东红化学厂),分析纯;氨丙基三乙氧基硅烷(APTES,Sigma公司),纯度99%;58SBG(采用溶胶-凝胶法实验室自制);正己烷(天津化学试剂一厂),分析纯;高糖DMEM(Gibco公司);PBS(广州威佳公司)。1.1干凝胶的制备室温下在烧杯中加入去离子水和1mol/L盐酸,磁力搅拌5min,随后边搅拌边加入正硅酸乙酯,搅拌30min,溶液转为清澈透明;缓慢滴加磷酸三乙酯,继续强力搅拌20min,最后缓慢加入硝酸钙,充分搅拌60min,即得到溶胶液。将溶胶液室温下静置陈化形成均匀透明的块状凝胶。凝胶在70℃干燥72h,180℃干燥48h。将得到的干凝胶置于坩锅中,放入快速升温箱式电炉中程序升温进行烧结。自然冷却后,在玛瑙研钵中研磨,得白色BG粉末。1.2aptes溶液称取一定量58SBG粉体,置于三口烧瓶中,加入5vol%的APTES的正己烷溶液,搅拌,氮气保护,70℃水浴加热10h。反应完成后,取出BG粉体,先后用正己烷、乙醇、去离子水反复清洗,离心分离,真空干燥箱中干燥至恒重备用。1.3mtt法检测细胞增殖将BG采用压片机压成直径约1cm、厚度约1mm的圆片,60Co辐射消毒;将修饰前后的BG圆片在DMEM培养液中浸泡7天;浸泡后的材料置于12孔培养板中,加入事先消化好的MC-3T3细胞悬液(密度2×104cell/mL),于37℃、95%湿度、5%CO2条件下培养箱中培养,隔2天换液1次,于培养第1、3、5、7天在预先设定的培养孔中,通过MTT法(四唑盐比色法)对细胞增殖进行测定。于培养第5天时,取出BG圆片,PBS冲洗3遍,用2.5%戊二醛于4℃固定1h;将固定好的材料用PBS冲洗干净,梯度乙醇脱水,乙酸异丙酯置换。临界点干燥,表面喷金后进行SEM观察。1.4热重分析和粒度分布采用美国Nicolet公司的NEXUS傅里叶变换红外光谱仪对修饰前后的BG进行结构表征;采用德国Netzsch公司STA449CJupiter型同步综合热分析仪对BG进行热重分析,在氧气气氛下,以Al2O3粉体为标样,升温速率20℃/10min;采用马尔文公司的MASTERSIZER2000激光粒度分析仪进行湿法(水作为分散剂)粉末粒度分布测试(采用超声进行分散);采用荷兰Philips30XLFEG型扫描电子显微镜(SEM)在样品喷金后进行微观形貌观察。2结果与讨论2.1aptes的ftir分析图1为58SBG、APTES以及经修饰后的BG的FTIR谱图。在图1曲线a未经修饰的BG谱图中,3430cm-1附近明显的吸收峰归属于表面丰富的硅羟基以及结合水O—H的伸缩振动峰,宽峰形显示出羟基间的缔合;1640cm-1处为BG毛细孔中和表面吸附的水引起的反对称O—H弯曲振动;850~1250cm-1之间的宽而强的吸收峰中包含了PO伸缩振动、Si—O伸缩振动和P—O伸缩振动峰;464cm-1处峰则由Si—O—Si键的弯曲振动引起。图1曲线b为APTES的FTIR谱图,3370cm-1附近为端氨基的N—H伸缩振动峰;2800~2980cm-1之间归属于饱和C—H的伸缩振动,1600cm-1附近为N—H的剪式振动,1480、1440、1390cm-1处为C—H的面内弯曲振动峰;1200~1000cm-1间较强的吸收峰由Si—O键的伸缩振动所致。而在经表面修饰后的生物活性玻璃FTIR谱图中(图1曲线c),可以清楚地看到在2930~2850cm-1出现了由于APTES的键连而引入的饱和C—H的伸缩振动,1500~1390cm-1为甲基、亚甲基的弯曲振动,1594cm-1则为氨基的N—H剪式振动(3000cm-1以上的N—H伸缩振动与BG原有的硅羟基伸缩振动重合),这些饱和C—H和N—H振动峰的出现表明硅烷偶联剂APTES已经键连到BG粉体的表面。2.2bg与温度相关性的研究图2为修饰前后BG的TG、DTG曲线。比较两图可以看到,二者在室温至200℃均表现出明显的失重,这是由于BG毛细孔内的水分和表面物理吸附的水分逸出所致。而在200~500℃温度范围内二者表现出显著差异,未经修饰的BG仅表现出较小的失重,这应该是由于部分与BG形成氢键的水受热蒸发所致,而在同一温度范围内,修饰后的BG则可观察到1个大的失重峰,这是键连上的硅烷偶联剂上带有的饱和烃基受热燃烧分解造成的质量损失;此外,修饰后的BG在665℃附近还出现1个小的失重峰,这应该是由于引入表面的烃基上未完全燃烧的碳继续氧化所产生的。由此可见,硅烷偶联剂的引入使得BG的热性能发生显著变化。上述FTIR谱图与TG/DTG曲线分析结果与之前所做的XPS结果相吻合,均表明硅烷偶联剂已结合到BG上。2.3未修饰bg的统计特性图3为BG的粒径分布。由图可知,反应前后材料的粒径分布变化不显著,仅表现出修饰后粉体大小分布更均一。而从数值上看,未经修饰的BG平均尺寸为15.50μm,中值粒径为9.06μm;经修饰后的平均粒径为15.79μm,中值粒径为8.96μm,变化不大,这是由于修饰主要涉及粉体表面的反应,对粉体本体不会产生明显影响。2.4mtt检测结果图4为随培养时间延长,MC-3T3细胞的增殖情况。可以看到,随着培养时间的延长,2种材料MTT检测的吸光度值均显著升高,说明细胞在修饰前后的BG上均显示出良好的增殖生长态势。经细胞培养1天,修饰后的BG表面MTT检测吸光度值略低于未经修饰的BG,差异不显著;培养3天后,修饰后的BG表面吸光度值则明显高于未经修饰的材料,显示在修饰后的材料上细胞表现出更好的生长增殖情况,这表明将APTES连接到BG表面不会产生细胞毒性,相反修饰后的材料更有利于细胞的增殖。2.5细胞生长形态图5为MC-3T3细胞培养5天后的SEM照片。可以发现,细胞在2种材料上均表现出良好的生长形态,有伪足伸出;修饰前的材料表面部分裸露,部分为细胞覆盖,而修饰后的材料表面基本为细胞覆盖,表现出更好的细胞相容性。3aptes键在bg上的应用(1)将APTES键连到了BG表面,修饰后BG的FTIR谱图上2930~2850cm-1、1500~1390m-1处归属于饱和C—H伸缩振动和弯曲振动峰