一个液相方法优化案例

分析方法是质量标准的重要组成部分，常用来检测活性成分、有机杂质、无机杂质、残留溶剂等，以检测药物是否符合其质量标准，确保其安全有效。在物料的日常检测（有关物质）中，通常会采用供应商提供的方法，但这些方法一般情况下仅满足样品检测需要，但是否满足系统适用性要求，需要进一步研究，具体例子如下：化合物结构：儿茶酚类似物色谱条件：色谱柱：XbridgeC18（4.6X250mm，5四m），波长254nm，流速：1.0ml/min，柱温：45°C，流动相A：10mM甲酸盐（甲酸调节pH值至3.0），流动相B：甲醇，稀释剂：甲醇梯度1如下：t/min0404545.155A9030309090B10707010101、溶剂效应导致肩峰。根据拟定的质量标准，配成杂质限度浓度的SST溶液，进样，结果如图1所示。主峰前的多个杂质的色谱峰成肩峰，推测原因可能是溶剂效应导致的。将SST溶液用流动相A稀释一倍，重新进样（进样量加倍），肩峰消失（详见图2），因此可以确定是溶剂效应导致的。溶剂效应的根本原因是样品进入色谱柱后，由于溶解或稀释样品的溶剂与流动相组成之间存在极性，溶解性存在差异，导致分析物在溶剂与流动相之间进行液-液分配直到平衡状态，部分取代了分析物在流动相与固定相之间的液固分配平衡，正是由于分析物液-液分配不能瞬间完成，导致溶剂效应［1］。因此，需要兼顾稀释剂与流动相起始比例的相容性以及样品的溶解性，一般使用初始流动相作为稀释剂；也可通过减小进样量来缓解溶剂效应。图1SST色谱图（主峰前色谱峰肩峰）

图2SST色谱图（主峰前色谱峰肩峰消失）2、缓冲盐浓度低导致肩峰。通过图2可以看出，6.7min的未知杂质峰仍然是肩峰（原图放大明显），可能的原因是缓冲盐浓度低，离子强度及缓冲能力弱，导致色谱峰呈现肩峰。加大缓冲盐浓度至25mM，该色谱峰峰行正常；通过使用苯基己基，该色谱峰峰行正常，主要是色谱柱填料不同，导致选择性不同。图325mM甲酸盐-SST色谱图（原6.7min色谱峰肩峰消失）图4苯基己基柱-SST色谱图（原6.7min色谱峰肩峰消失）3、柱温过高导致峰重合。柱温也是影响分离度的一个参数，通常情况下，柱温升高，色谱柱背压降低，出峰时间提前（尤其是离子化合物）。在本实验中，降低色谱柱柱温（35°C、30°C），16.8min色谱峰（图3）变为2个色谱峰，详见图5。主要原因是柱温较高时，后面的峰跑到前面，与之重合。因此，在方法开发时，尽可能的将柱温控制在35C以下。图5柱温30C-SST色谱图4、溶剂干扰。甲醇的色谱图中有较大的未知色谱峰，对检测有干扰（图534min色谱峰），更换默克试剂，无干扰；也可以尝试使用鬼峰捕集小柱，通过吸附溶剂中的污染物，排除干扰。5、进样四针后，色谱图出现鼓包。可能是流动相积累到色谱柱柱头，污染导致。前面梯度不变，在后面一段时间增加有机相比例，在52.5min后出现两个大的未知色谱峰，但这两个色谱峰在空白及进样0叱色谱图中都存在，说明是空白中引入的；考虑到运行时间过长以及甲酸盐易受污染，更换缓冲盐体系为20mM磷酸盐，分别通过梯度1及2连续进样，未见鼓包，且杂质谱未改变。修改后梯度2：t/min040455555.165A903030109090B107070901010图6鼓包色谱图

图7空白色谱塔（升高有机相比例）BD：«>1GOD：*噂OlWj图8升高有机相比例（20mM磷酸盐）-SST色谱图图8原色谱条件（20mM磷酸盐）-SST色谱图通过上述内容可以看出，在前期的方法开发中，对于稀释剂的选择、缓冲盐的体系、色谱柱柱温、色谱柱的类型（注意通用性）、有机相比例的选择尤为重要，具体