脂质体制备方法

微脂體(又称脂质体)及其制备方法一二微脂體(又称脂质体)微脂體起源於1960年月中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上参加含鹽分的水溶液後，再加以搖晃，會使脂質形成具有通透性的小球；1968年，Sessa和Weissmann等人正式將此小球狀的物體命名為微脂體〔liposome〕並做出明確的定義:指出微脂體是由一到數層脂質雙層膜(lipid bilayer)所組成的微小的囊泡，有自行密合〔self-closing〕的特性。微脂體由脂雙層膜包裹水溶液形成，由於構造的特性，可同時作為厭水性〔hydrophobic〕及親水性〔hydrophilic〕藥品的載體，厭水性藥品可以嵌入脂雙層中，而親水性藥品則可負電荷、正電荷。此外，磷酸脂碳鏈局部的長短，不飽和鍵數目，會決定微脂體的臨界溫度(transitiontemperature,Tc)，影響膜的緊密度。一般來說，碳鏈長度越長臨界溫度越高，雙鍵數越多則臨界溫度越低，常見的DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine)与DSPC(distearoylphosphatidylcholine)的臨界溫度分別是42℃56℃，而EggPC(eggphosphatidylcholine)與POPC(palmitoyloleoylphosphatidylcholine)的Tc則低於0℃。臨界溫度影響微脂體包裹及結合藥物的Tc在的時間較長。微脂體可依脂雙層的層數或是粒子大小，加以命名或分類：Multilamellar vesicle〔MLV〕是具有多層脂雙層之微脂體，粒子大小介於100-1000nm直接水合後，即形成MLV，體積通常較為龐大，脂質含量較高。MLV的脂雙MLV又稱為oligo-lamellarliposomespaucilamellarvesicle。LargeUnilamellarVesicle(LUV)則是單層脂雙層所構成的微脂體，一1000nm等級(250-2500nm或更大)的微脂體，動物細胞便是一種LUV。Intermediate-sizedUnilamellarVesicle(IUV)也是單層脂雙層所構成的100nm等級(25-250nm)的微脂體。不過，目前一般文獻已經很少使用IUV，而是將它併入SUV中。SmallUnilamellarVesicle(SUV〕是單層脂雙層所構成的小微脂體，早期的分類指特定磷酸脂所能夠成的最小微脂體(一般以超音波震盪製成)如eggPC以生理食鹽水(normalsaline)水合的SUV是15nm；DPPC 則是25nm。的方法，包括：1.)薄膜搖振法〔Thinfilmmethod;Hand-shakingmethod〕：又稱做Bangham’smethod，將脂質以有機溶劑如氯仿〔chloroform〕、甲醇〔methanol〕及乙醇〔ethanol〕等溶解，均勻混合後，利用旋轉真空乾燥機(rotaryevaporator)使圓底瓶內的溶劑揮發之後，即可在瓶壁上形成均勻的脂質膜，在臨界溫MLV。2.)冷凍-再解凍(freez-thaw)、均質(homogenization)及超音波震盪法〔sonicationmethod〕：利用微脂體裂开後會再自行密合的特性，以機械性的力气均組再密合，最後可形成大小較均勻的單層微脂體。3.)反相蒸發法〔Reversephaseevaporationmethod〕：以有機溶劑溶解適合用來包覆較為稀有或是較珍貴的藥品及蛋白質。4.)(solventinjection)和清潔劑透析法(detergentdialysis)：利用有機溶劑和清潔劑溶解脂質，與準備包覆的水溶液混合形成微脂體後，以透析法除去有機溶劑和清潔劑。5.)濾膜擠出法〔Extrusion〕：可將上述方法製成的微脂體，改變成所需粒MLVLUV置於擠壓器(extruder)微脂體。利用這種方法製成的微脂體可將粒徑大小掌握到一百奈米以下。兩類血漿蛋白發生作用，1〕所謂調理素〔opsonins)可附著於微脂粒外表，促使其被RES之吞食細胞噬食。2〕高密度脂蛋白〔HDL〕襲擊微脂粒，藉phosphatidylcholinetransferase活性蛋白之助，抽掉微脂粒上之磷脂分子，使微脂粒微脂粒〔stealthliposomes〕。微脂粒聚拢至目標細胞。微脂粒與細胞作用的機制有數種：1〕膜組成交換〔intermembranetransfer〕：即微脂粒膜的組成與細胞膜的組成中有一部份相互交換；2〕吸著〔adsorption〕：微脂粒附著於細胞膜；3〕膜融合〔fusion〕：微脂粒與細胞膜融合，將包涵物送進細胞內；4〕吞食〔phagocytosis,endocytosis〕：微脂粒被細胞吞食。欲使微脂粒依期望之機制與細胞作用，則要設計微脂粒。阳离子脂质体(cationicliposome)80年月中期进展起来的一种最具创性的、高效的转染(transfection)技术。阳性脂质体(cationicliposome),又称阳离子脂质体、正电荷脂质体(positivelychargedliposome),是一种本身带有正电荷的脂质囊泡。它可作为荷负电物质的传递载体,特别适用于蛋白质、多肽和寡核苷酸类物质、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等,所以在基因治疗方面有独特应用,近年来，成为在体外争论培育体系中均能应用，并且能得到顺时表达〔transientexpression〕和稳定表达〔stableexpression〕的细胞株。阳性脂质体的组成分子层。其中,中性磷脂起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用,同时供给阳,多为双链季铵盐型外表活性剂,为整个脂质体供给正电荷，有很强的细胞膜去稳定化作用。目前，使用最广泛的阳性成分有以N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、3β-[N-(Nˊ,Nˊ-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)2,3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸铵(DOSPA)、1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵(DOTAP)等，具有体外稳定性好，体内可被生物降解的特点，但具有肯定的细胞毒性。阳性脂质体介导基因转染的作用机制DNA形成脂质体-DNA复合物〔2〕与细胞膜的作用〔3〕DNA释放到细胞中。阳性脂质体-DNA复合物〔Lipoplex〕的形成附，这样通过阳性脂质体的介导，可以把核酸物质结合到细胞膜上。Gershon1993年使用电镜技术,争论了复合物的形成和构造特征。他认为,阳性脂质体DNA分子上,程度时,DNA诱导的脂质体膜融合和脂质体诱导的DNA断裂同时发生,断裂后的DNA分子被包封于重形成的脂质体中。后来，StefanHuebner1999年DNA的电荷比例有亲热联系。复合物有三种形式：〔1〕DNA包裹的单层囊泡〔2〕由单层囊泡组成的寡聚复合物〔3〕多层囊泡聚合物。并且他提出“脂质体滚动”DNA包裹的单层囊泡被另一个“模板”囊泡吸附，随即发生断裂，沿着“模板”囊泡“滚动”，依此类推，就形成了多层囊泡聚合物，这就解释了复合物缺口形成的缘由。目前，这一观点已渐渐为宽阔争论者所认可。细胞对阳性脂质体-DNA复合物的摄取最初的争论指出，最初的争论指出,对于带负电荷的核酸物质(DNA、RNA和寡核苷酸),主要是通过胞饮作用(endocytosis)(endocytosis),将复合物包封于有衣小泡(coatedvesicle)内。进入细胞质后,有衣小泡形成内吞小泡(endosome),与其它细胞内囊泡融合,又将内吞物转送到溶酶体〔lysome〕内,实现内吞作用介导的脂质体与细胞的融合。还有一种假说是融合理论：阳性脂质体与细胞结合后,脂质体膜和细胞膜外表重合局部发生融合,DNAWrobelG2(HepG2)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为靶细胞,争论了脂质体与细胞的融合过程,证明内吞作用是融合的关键。在三磷酸腺苷(ATP)耗竭剂和高渗介质等抑制内吞作用的物质存在下,脂质体只能与细胞外表结合,不能实现内吞作用，而此时转染效率较无抑制剂的比照Leventis等觉察阳离子脂质体与细胞融合活性和转染率不全都,证明融合机制不是其转运的主要渠道。所以，人们认为细胞对阳性脂质体-DNA复合物的摄取主要通过内吞作用来实现的。阳性脂质体-DNA复合物〔Lipoplex〕在细胞内释放DNA的机制Hopkins等指出阳离脂质体-DNA复合物进入细胞内与溶酶体(lysome)膜融合，主要分布于核周高度有序的管状构造中,如核内体(endosome)中,含有阳离子脂质体–DNA复合物的核内体膜极不稳定,可以释放出复合物。Farhood等在争论中也DNA向细胞的传递过程,因此,认为脂质体的主要功能是使内吞小泡去稳定化,DNA释放到细胞中。影响阳性脂质体介导的基因转染效率的因素DNA的电荷比例Huebner等应用冷冻蚀刻电镜技术〔cryoandfreeze-fractureelectronicmicroscopy〕觉察，阳性脂质体与DNA的电荷比例打算了复合物的构造和大小，电荷比例有0.2的差距，其复合物的构造、大小都有很大差异。不加DNA的状况下，脂质体是单层囊泡〔unilamellarvesicles〕形式存在，其直径为65nm〔±18nm〕。当DNA的比例较少时，复合物多以多层囊泡聚合物〔multilamellarcomplex〕形式存在，其直径较单层囊泡要大的多。当DNA的比例较高时，复合物多以DNA包被的单层囊泡〔DNA-coated,andfusedDNA-coated,unilamellarvesicles〕构造存在也有少量寡聚复合〔clusterofDNA-coated vesicle〕，其大小较多层囊泡聚合物小的多不同类型的细胞其吸取大小各异颗粒的力量也不尽一样。依据具体状况预备适宜的脂质体-DNA复合物对于转染效率是很重要的。细胞的状态〔passage〕，1：31：5的比例分瓶，具体的传代间隔时间以细胞的生长周期来打算。同时转染时机的把握也很重50％～70％为宜，留意在转染时培育瓶内细胞不能长满。血清血清中的载脂蛋白与脂质体的相互作用会导致脂肪酸链运动的自由度降低,双分子层积存特性转变和脂质从脂质体转移到载脂蛋白上,使脂质体膜的通透性增加,最终裂开。其次血清白蛋白、抗磷脂抗体和可溶性脂交换蛋白也可引起脂质体膜的不稳定。DNA-脂质体复合物同细胞通常是在无血清环境下作用的,假设局部转染要在肯定百分比的血清浓度下才能完成,但脂质体-DNA复合物仍必需-DNA复合物形成过程中血清存在的话将会降低转染的表达活力,这可能是由于复合物同带负电荷的血清蛋白结合,电荷被中和的原因,但当脂质体-DNA复合一旦形成,影响就不那么明显。载体在实施转染的过程中,选择适合的转染载体如同选择恰当的细胞株和培育条,有时也包括病毒序列。完成转染过程后,一些基因挨次允许载体在细菌(如一般的大肠杆菌)DNA;另外的一些序列则是在真核细胞中克隆化,最终导致细胞死亡,它们只能用于临时性的表达;另一类不在真核细胞内复制的载体可同时应,在真核细胞中允许非指数复制,这就可能不通过整合作用而得到稳定的表达。阳性脂质体的阳性成分很多争论说明,阳性脂质体的阳性成分对于基因的转染率有很大影响。Claire等以几种不同的阳性脂质体介导质粒DNApSV-CAT转染3T3脂肪细胞,以氯霉素乙酰基转移酶(CAT)活性代表转染率,结果说明转染率依次为:LipofectAMI>>Cheng-DNA-转铁蛋白半乳糖苷酶基因转染人宫颈癌上皮细胞(Hela)DC-Chol>LipofectAMINEPinnaduwageDTAB,TTAB,CTAB介导Lipofectin。4. 阳性脂质体介导转染法的优点及应用前景阳性脂质体作为一种高效的基因传递载体,具有以下优点:①可防止核酸被体可生物降解。③易于制备,使用便利,可将大的DNA片断转运到细胞中。④基因转染率高,离体细胞可以瞬间表达外源基因。目前，阳性脂质体介导转染技术在基因治疗领域中将发挥其无穷的潜力。制作方法一二：LipidsandlipidvesiclesEgg-phosphatidyl-choline(egg-PC),dipalmitoyl-phosphatidyl-choline(DPPC),dimyristoyl-phosphatidyl-choline(DMPC)andcholesterol(Chol)wereobtainedfromAvantiPolarLipids,Inc.(Alabaster,AL)andstoredinchloroform.Alllipidswereusedwithoutfurtherpurification.HighgradedmicawaspurchasedfromTedPella,Inc.(Redding,CA).PurewaterwasobtainedwithaMilliQsystem(Millipore,Beford,MA).Oneofmethodsforpreparingsupportedbilayersisbyfusionofvesicles.Largeunilamellarvesicles(LUV)werepreparedbythefreeze-thawextrusionmethod.Thelipids,dissolvedincholoform,weredriedtoathinfilm underastreamof rogen,and weredriedovernightin vacuumforthesolventtocompletelyevaporate.Thelipidfilmwasthenhydratedandmixedby vortex.Aftersixfreeze-thawcyclesthesuspensionwaspassedthroughtheloresofapolycarbonatedmembrane(200nm,AvantiPolarLipids Inc.)withtheaidofalipidextruder(AvantiPolarLipids Inc.).Vesiclesolutionsweremadeinaqueoussolutionandthendilutedtothedesiredconcentrationina10mMMgCl2solution.ILSMethodAnothermethodforpreparingsupportedbilayersintheexperimentisbydepositingtwomonolayersontomicasubstrate.Thefirstmonolayerisdepositedbyinverse-LSmethod6.Mica,whichhavea hydrophilicsurface,wassubmergedjustbelow thesubphasesurfacebeforethemonolayerwasspread.Monolayerwasthenspreadandcompressedtothedesiredsurfacepressure.Thesubphasewasaspiratedout