心力衰竭大鼠压力感受性反射与脑内活性氧簇升高的关系

心力衰竭大鼠压力感受性反射与脑内活性氧簇升高的关系

动脉压的感受性反射是心血管活动的主要调节机制。它以负反映的形式保持动脉血压的稳定，是一种抑制血液循环和反射的机制。慢性充血性心力衰竭(简称心衰)时,压力感受性反射调节心率和肾交感神经活动的功能减弱,导致交感神经活动增强、外周阻力增加,进一步加重心脏负担。有研究证实,压力感受性反射功能衰减促进心衰发展,提示心衰的预后不良。因此,探讨压力感受性反射衰减的机制对于阻止心衰的恶化具有重要意义。动物研究提示,脑内肾素-血管紧张素系统激活是介导心衰状态下压力感受反射衰减的重要机制。Gao等报道慢性心衰家兔延髓头端腹外侧区血管紧张素II(angiotensinII,AngII)I型受体(AT1)mRNA和蛋白表达增强。慢性心衰大鼠的孤束核、延髓头端腹外侧区、下丘脑室旁核等心血管中枢AT1受体的蛋白表达也上调。血管紧张素转换酶抑制剂(agiotensinconvertingenzymeinhibitor,ACEI)或AT1受体拮抗剂losartan能恢复受损的压力感受性反射功能。但是,中枢AngII增加导致压力感受性反射功能衰减的细胞内机制尚不清楚。活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)作为AngII通路的细胞内信号分子在心血管的病理生理学领域中作用已引起广泛关注。AngII不仅增加脑内ROS水平,而且提高NADPH氧化酶的活性,还可上调NADPH氧化酶的表达。心衰时血浆AngII和脑脊液中AngII升高,有研究提示脑内ROS升高与心衰动物压力感受反射功能减弱密切相关,但具体脑区有待进一步研究。下丘脑是压力感受反射的整合中枢和控制交感神经传出活动的关键脑区,心衰时下丘脑ROS在压力感受反射中的作用以及下丘脑ROS水平与来源均未见报道。本实验在心肌梗死诱发心衰的动物模型,研究压力感受性反射功能减退与下丘脑ROS升高的关系,探讨压力感受性反射功能衰减的细胞机制。材料和方法1化学试剂及试剂雄性SD大鼠,体重(180-220)g,由美国内布拉斯加医学中心动物实验室提供。苯肾上腺素、硝普钠、tempol、apocynin、DETC(diethyldithiocarbamate)等化学试剂购自Sigma。gp91phoxⅠ抗为兔抗,Ⅱ抗为山羊抗兔IgG(SantaCruz),ECL及BCA试剂盒购自Pierce。呼吸机(Harvard),冰冻切片机(Leica)。化学发光测定仪(Sirius),UVP凝胶成像系统(Upland),生物信号采集和处理系统(PowerLab),脑立体定位仪(Stoelting)。2方法2.1呼吸静化学检查36只SD大鼠随机分为心衰组和对照组。心衰由结扎左冠状动脉前降支造成心肌梗死所引起的。动物经3%异氟醚吸入麻醉,气管插管并与呼吸机相接,人工通气。左侧第五肋间开胸,剪开心包膜暴露心脏,在左心耳与肺动脉圆锥之间、左冠状动脉前降支起始处用6-0号手术线缝扎,逐层关胸,负压抽吸胸腔内积液和气体。待动物自主呼吸恢复后,拔除气管插管,单笼饲养7d。假手术组除不结扎冠状动脉外,其余步骤同心衰组。术后6周,两组动物做超声心动图,测定心脏血流动力学和左心室内径。术后6-8周,动物进行压力感受反射功能测定后,取出心脏,去除大血管、心房和右心室游离壁,沿室间隔纵向剪开左心室,摊平,用视频扫描仪将整个左室面积(包括室间隔)扫描到电脑中,用SigmaScan软件计算出左室总面积和心梗疤痕区面积,心梗面积=梗死区面积/左室总面积×100%。2.2肾市场中压力感受反射对血压的影响冠状动脉结扎术后6-8周,两组动物在乌拉坦(800mg/kg)和α-氯醛糖(40mg/kg)麻醉下行气管插管,机械通气。将头端带有压力传感器的动脉导管经左侧颈总动脉向心脏方向插入,经主动脉瓣逆行进入左心室,测得心室内压(信号由PowerLab信号处理系统保存)后,动脉导管退出左心室,停留在颈总动脉内,测定血压,心率由脉搏波触发计算。分离左侧肾交感神经,置于引导电极上,用Kwik-Sil胶将神经与电极包绕,起到绝缘目的。血压、肾交感神经放电、放电积分等输入PowerLab信号处理系统。先静脉注射硝普钠将动物的血压降至50-60mmHg,紧接着静注苯肾上腺素,将血压从50-60mmHg升至150mmHg左右,反射性地引起肾交感神经放电逐渐减弱,甚至完全被抑制。将血压变化和肾交感神经放电的反应作非线性回归分析,所得到的曲线被称为压力感受反射调节肾交感神经活动的功能曲线。非线性回归分析方程为:RSNA=A/{1+exp[B(MAP-C)]}+D,其中A为肾交感神经放电的变动范围,反映压力感受反射的调节范围;B为曲线的平均斜率,代表压力感受反射的敏感性;C为血压变化中点处(BP50)的血压值,代表压力感受反射的调定点;D为曲线的低平台,反映肾交感神经受抑程度。压力感受反射功能曲线的最大增益(Gainmax)利用另一公式Gainmax=A1×A2×1/4计算,A1为肾交感神经放电的变动范围,A2为平均斜率。2.3压力感受反射功能测定动物麻醉后俯卧位固定于大鼠立体定位仪,顶部正中切开,暴露前前囟,根据大鼠脑图谱进行定位,侧脑室坐标分别是:前囟后0.8mm,中线旁开1.4mm,颅骨表面下3.8mm。颅骨钻孔后插入微量注射器(10μL),微量注射器与微量灌流泵相接。Tempol(1mmol/L)、apocynin(1mmol/L)、DETC(1mmol/L)3种药物以1μL/min速度持续灌流10min后,测定压力感受反射功能的变化。每次给药间隔时间至少30min。实验结束后,2%滂胺天蓝进行注射点定位。2.4净生成量的测定采用化学发光法测定ROS水平。2组大鼠深度麻醉后,断头,迅速取出全脑放在冰盘上,分离出下丘脑组织,放入预冷(4℃)的Krebs/Hepes缓冲液中(pH7.4)。下丘脑组织切成2mm×3mm×2mm的小块,保存于Krebs/Hepes缓冲液中、冰上放置。测定时需避光,试管内加入预热(37℃)Krebs/Hepes液4.5mL,然后加入lucigenin和组织块,lucigenin终浓度为5μmol/L。试管放入化学发光测定仪中,每30s测定1次发光量,持续5min。其中只加lucigenin不加组织块的试管是空白对照。超氧阴离子的净生成量=(测试管-空白管)/组织块的重量,单位为relativelightunit(RLU)·5min-1·mg-1。为了确定超氧阴离子的来源,下丘脑组织分别与NADPH氧化酶抑制剂apocynin(1mmol/L)、一氧化氮合酶抑制剂NG-monomethyl-L-argine(L-NMMA,1mmol/L)、黄嘌呤氧化酶抑制剂oxypurinol(1mmol/L)、线粒体呼吸链抑制剂rotenone(0.5mmol/L)预处理30min,然后按上述方法进行测定。2.5westernblotting检测ca-射线衍射蛋白表达氧化酶亚单位的蛋白水平检测每只动物在压力感受反射功能测试结束后,取出全脑、干冰速冻、-80℃冰箱保存。冰冻切片机将脑作冠状切片,片厚100μm,在包含室旁核平面的下丘脑脑片上,用16号平针头取下室旁核组织,两侧的组织块放在一起作为1例样本。室旁核组织加入含蛋白酶抑制剂的裂解液,冰上匀浆、超声破碎30s,4℃以12000×g离心20min,收集上清液。采用BCA试剂盒测定上清液中总蛋白浓度,Westernblotting方法测定上清液中NADPH氧化酶亚单位gp91phox蛋白表达。取总蛋白40μg,经10%SDS凝胶电泳分离后,转移至PVDF膜。分别用兔抗gp91(Ⅰ抗,1∶2000稀释)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Ⅱ抗,1∶5000稀释)与PVDF膜孵育,ECL曝光,用UVP生物图像处理系统对蛋白条带进行扫描和密度分析。以GAPDH为内参照,gp91phox与GAPDH的比值代表gp91phox的蛋白表达量。3分组间比较采用stungntt检验数据以均数±标准差(ˉx±s)(x¯±s)表示,组间比较采用Studentt检验,给药前后采用配对t检验。用SigmaStat统计软件进行数据分析。结果1血压、左室收缩期及左室扩张期压力心衰大鼠的体重与对照组无显著差别,但左室重量大于对照组(P<0.01)。2组大鼠的血压、无明显差异,但心衰大鼠的心率加快(P<0.05)。心衰组左室收缩末期及舒张末期的内径大于对照组,而左室舒张末期压力显著高于对照组(P<0.01)。心衰大鼠的心梗面积占左室总面积的(39.8±4.1)%,见表1。2肾两种功能结构的相对差异压力感受性反射功能曲线呈“S”型,见图1。当血压升高时,反射性地引起肾交感神经活动抑制。心衰组压力感受性反射功能曲线的范围、平均斜率和最大增益均低于对照组,而肾交感神经活动最低值高于对照组(P<0.01)。2组大鼠BP50无显著差异,见表2。3压力感受反射曲线超氧阴离子捕获剂tempol和NADPH氧化酶抑制apocynin增强心衰大鼠压力感受反射功能曲线的范围、平均斜率和最大增益,但不影响对照组压力感受反射曲线各指标;超氧化物歧化酶抑制剂DETC则抑制对照组大鼠压力感受反射功能,对心衰组无明显影响,见图2。4无砂混凝土面为0.0的情况心衰组下丘脑组织中超氧阴离子的浓度明显高于对照组(P<0.01)。Apocynin降低心衰组超氧阴离子的浓度,而oxypurinol、rotenone和L-NAME预处理则不影响心衰组超氧阴离子的浓度,见图3。5室内侧核nadh氧化亚单位的蛋白质表达心衰大鼠室旁核gp91phox蛋白表达明显增强,比对照组增加了1.3倍,见图4。压力感受反射功能的衰减本实验观察到心衰大鼠动脉压力感受反射调节肾交感神经活动的作用明显减弱,这与其它实验性心衰动物所观察的结果一致。和对照组比较,心衰组压力感受反射调节肾交感神经活动的敏感性和幅度均降低,表现为压力感受反射功能曲线平均斜率和最大增益的减小,而且压力感受反射调节肾交感神经活动的范围也缩小,表现为降压时肾交感神经活动的增幅减小和升压时肾交感神经活动受抑程度减弱,压力反射功能曲线的最低值升高(图1)。在心衰病人,压力感受性反射调节心率的功能也降低,出现心交感神经活动加强和心动过速,严重的引发室颤和心脏猝死,增加心衰的死亡率。压力感受性反射功能减退的机制研究表明,心衰时体内肾素-血管紧张素系统激活,血浆和脑脊液中AngII增加,血浆AngII升高能明显抑制动脉压力感受性反射。相反,血管紧张素转换酶抑制剂或AT1受体拮抗剂能恢复受损的压力感受性反射功能。但介导AngII衰减压力感受性反射功能的细胞内信号分子并不清楚。本实验发现心衰大鼠下丘脑超氧阴离子浓度明显高于对照组(图3),侧脑室给予超氧阴离子捕获剂tempol能改善受损的压力感受反射功能,而应用SOD抑制剂DETC则降低对照组压力感受反射功能(图2),提示心衰大鼠下丘脑超氧阴离子升高是压力感受性反射功能的衰减的重要机制。Gao等也报道心衰家兔延髓头端腹外侧区超氧阴离子增加与压力感受反射功能衰减密切相关。下丘脑和延髓头端腹外侧区均为压力感受反射的整合中枢,压力感受器传入冲动经孤束核上行至下丘脑,下丘脑还接受大脑皮层、皮层下结构的下行冲动,在此整合后,发出下行神经纤维投射到延髓头端腹外侧区和脊髓中间外侧柱,调节交感神经活动。因此,下丘脑超氧阴离子升高导致神经细胞的氧化应激,可能影响压力感受反射的中枢整合过程,继而影响到延髓头端腹外侧区和脊髓中间外侧柱的交感传出活动,这些脑区超氧阴离子浓度升高更好地说明压力感受反射功能减退的中枢机制。超氧阴离子是重要的活性氧成分,由多种致氧化酶催化底物生成的,如NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、线粒体呼吸链以及一氧化氮合酶等。在外周组织AngII引起超氧阴离子增加主要源于NADPH氧化酶,在中枢神经系统对超氧阴离子的来源研究较少。本实验分别应用上述氧化酶抑制剂预处理心衰大鼠的下丘脑组织,仅NADPH氧化酶抑制剂apocynin能抑制超氧阴离子的生成,其它氧化酶抑制剂对超氧阴离子的生成无明显影响,这一结果表明,心衰时脑内超氧阴离子增加主要来自NADPH氧化酶。NADPH氧化酶由细胞膜亚单位(gp91phox、P22phox)、胞浆亚单位(P67phox、P47phox、P40phox)和Rac1共同组成。当细胞膜亚单位与胞浆亚单位分离时,NADPH氧化酶没