硫化氢对大鼠肾感活动的影响

硫化氢对大鼠肾感活动的影响

高血压是最常见的疾病，也是心脑血管疾病的主要危险因素。高血压的预防和治疗是中国高血压疾病的出发点。而在我国目前面临高血压发病率高,发病人群越来越年轻化的情况下,高血压必须以预防为主,因此血压的调控成为研究重点。已有研究发现多类高血压患者血浆中H2S水平明显降低,与收缩压和舒张压成负性相关。近年来在大鼠、牛和人类等大脑中发现了含量在50~160μmol·L-1的内源性的H2S,人们开始逐渐意识到其在中枢中的作用。在哺乳动物的中枢神经系统,H2S主要由L型半胱氨酸通过胱硫醚-β-合成酶(CBS)的作用内源性生成。交感神经系统是机体血压调节的重要组成部分,其活动的相对平衡是维持血压稳定所必需的。正常血压调节过程中,血压下降会引起快速交感神经激活,从而使血压升高,以维持血压稳定和机体正常机能。而大量的实验证实肾是交感神经活动激活的靶点同时也是引起交感神经活动增强和维持的重要因素,因此可以通过肾交感神经的活动反映心血管以及中枢的交感神经活动水平。早在19世纪70年代就有学者研究中枢神经系统对血压的调节作用,并发现血管运动中枢位于延髓的腹侧部分。而室旁核(PVN)的下行纤维能够投射到延髓头端腹外侧部,进而调控心血管活动。因此,我们将H2S与PVN结合起来研究H2S在中枢对血压的调控作用,为临床研发预防和治疗高血压疾病的新药提供实验依据。1材料和方法1.1复合立体定位仪PowerLab8/30数据采集分析处理系统及桥式放大器(澳大利亚ADInstruments公司);68003型单臂数字式立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);XSD-100体式显微镜(蚌埠光学仪器厂);Strong90式颅骨钻(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);微量进样针(上海安亭微量进样器厂)。1.2硫氢化钠、l-半胱氨酸盐酸酯盐酸盐液体石蜡的合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosy-L-methionine,SAM)、氨氧乙酸(amino-oxyacetate,AOA)、硫氢化钠(NaHS)、L-半胱氨酸(L-Cysteine)(Sigma公司);液体石蜡(上海中试化工总公司);配制微量注射试剂SAM、AOA、NaHS和L-Cystenine均用生理盐水作溶剂。1.3细胞密度♂SD大鼠,(220~250)g,35只,SPF级,由安徽医科大学实验动物中心提供。实验大鼠随机注射不同药物,NaHS/L-Cyteine/SAM/AOA,每只大鼠在实验时注射两种不同药物且注射总量不超过0.6μl,在注射药物前均先注射0.1μl的溶剂做对照。1.4方法1.4.1血压、动脉和血压监测腹腔注射乌来糖(600mg·kg-1)+氯醛糖(30mg·kg-1)的混合麻醉剂。依次进行气管插管,左颈外静脉和左颈总动插管术。左颈外静脉与注入生理盐水溶液的PE50聚乙烯管相接,左颈总动脉与充有肝素钠生理盐水溶液的PE50聚乙烯管相接,通过压力换能器与PowerLab8/30数据采集分析处理系统实时记录手术过程大鼠的动脉血压(ABP)、平均动脉压(MAP)及心率(HR)。药物对MAP的改变水平以注射药物前后实测值之差表示,ΔMAP=(MAPpre-MAPafter)。1.4.2数据处理和分析处理采用脊柱旁纵行切口方法,在腹主动脉附近区域游离左肾交感神经,并浸入石蜡油中,用双极银制电极引导RSNA,通过PowerLab/8SP数据采集分析处理系统记录原始RSNA(RawRSNA),并对RSNA进行积分处理,同步记录RawRSNA和整合RSNA。实验结束时切断肾神经中枢端从而消除肾交感神经传出活动,记录噪音值。通过RSNA变化值(ΔRSNA)占实际RSNA积分值的比例来评价RSNA的改变水平,可根据公式ΔRSNA/%=(RSNApre-RSNAafter)/(RSNApre-RSNAnoise)×100%计算得到。1.4.3pvn微量注射组将大鼠头部固定于立体定位仪上,根据Paxinos和Watson的大鼠脑立体定位图谱进行定位,并行双侧PVN插管(AP:-1.8mm,RL:0.4mm,H:7.9mm)。单侧PVN微量注射药液体积为50nl,双侧同时进针注射,于1min内注完,术毕留针1min。若注射后20min内大鼠的血压值没有恢复正常,则该只老鼠的数据剔除。实验结束时再注入50nl的2%伊文斯蓝,然后断头取脑,将其放入10%福尔马林溶液中固定1周后行脑组织冠状切片鉴定注射位点,注射位点不在PVN范围内的数据不予采用。1.4.4统计处理实验数据以ue0af±s表示,采用SPSS17.0软件对所有数据进行方差分析,两组间均数的比较采用t检验。2结果2.1降解map和rsnaPVN内微量注射H2S供体NaHS(0.1、1.0、5.0、10.0、20.0nmol),剂量依赖性的降低MAP和RSNA。与生理盐水组相比,大剂量的NaHS(20nmol)引起MAP[(0.0538±0.0926)vs(-0.7072±0.0902)kPa,P<0.01;Fig1A]和RSNA[(0.24±1.22)%vs(-11.52±1.73)%,P<0.01;Fig1B]明显降低。2.2明显升温map和rsna与生理盐水组相比,双侧PVN微量注射CBS抑制剂AOA(10nmol),明显升高MAP[(0.0538±0.0926)vs(0.946±0.1035)kPa,P<0.01;Fig2C]和RSNA[(0.23±1.22)%vs(14.24±3.82)%,P<0.01;Fig2D]。2.3kpa和rsna与生理盐水组相比,PVN内微量注射H2S前体L-cysteine(L-Cys,1nmol)增加内源性H2S的含量,同样也使MAP[(0.0538±0.0926)vs(-0.9252±0.1083)kPa,P<0.01;Fig2C]和RSNA[(0.23±1.22)%vs(-11.61±1.71)%,P<0.01;Fig2D]明显降低。2.4双侧PVN微量注射CBS激动剂SAM对大鼠MAP和RSNA的影响与生理盐水组相比,双侧PVN微量注射CBS激动剂SAM(10nmol)对MAP和RSNA无影响(Fig2)。3内源性hs可能在地位血压调控中起作用NO和CO最初被认为是精氨酸和血红素代谢的副产物,但是现在却被认为是气体信号分子。越来越多的研究表明,H2S不仅仅是L-半胱氨酸代谢的产物,更是一种新型的气体信号分子,具有通过一氧化氮介导的或非一氧化氮介导的机制舒张血管平滑肌、通过NMDA受体提高神经元兴奋性和抑制血管平滑肌细胞增殖、减轻血管重构等多种生物学效应。实验发现在PVN中注射NaHS能够剂量依赖性地引起血压下降和交感神经放电的减弱。NaHS溶解释放H2S,但仍有一部分以HS-形式存在。在哺乳动物体内为了维持内环境的pH和温度,只有1/3为气体H2S形式,浓度为18.5%左右。因此,能够引起MAP产生明显性变化的内源性H2S浓度为35~70μmol·L-1,没有超出脑组织中H2S的生理浓度(50~160μmol·L-1)。由此推测,内源性H2S有可能在中枢血压调控中起作用。在哺乳动物体内H2S的合成途径中L-cysteine主要起到前体作用。CBS主要起以下两个作用,一是将L-半胱氨酸转化为胱硫醚(是甲硫氨酸和半胱氨酸相互转换的基本步骤);二是以L-半胱氨酸为底物合成H2S。CBS抑制剂AOA能使血压升高、交感神经放电增强;H2S前体L-cysteine引起血压下降、交感神经放电减弱,这些实验数据说明PVN中的内源性H2S可能参与中枢血压调控作用。CBS抑制剂AOA不仅能够抑制CBS同时也对GABA受体有作用,能刺激氨基丁酸能的神经传递,增加GABA的水平。而早有研究发现GABA抑制剂会使血压升高,激动剂会使血压降低。因此可以排除CBS抑制剂AOA对GABA的作用,更加确定其升血压作用。综上可知,注射H2S前体或是CBS抑制剂使MAP、RSNA发生改变都是由于内源性H2S水平改变引起,而不是其他作用产生。CBS激动剂SAM不能引起血压的变化可能是由于SAM使CBS酶活性增强3倍导致内源性H2S合成增加,高水平的H2S超出了能产生作用的浓度范围,可能使机体产生反馈性抑制作用,从而使血压没有明显改变。近年来H2S在高血压、心肌缺血性损伤、心肌肥厚、动脉粥样硬化、冠心病、休克等心血管疾病发病中作用的研究进展迅速,并发现了许多分子靶点,包括K-ATP通道(以肌浆网K-ATP通