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文档简介

实时荧光定量PCR技术原理及其应用杨文斌20071.原理及其应用

2.应用ABI7000sybrgreen方法进行样品检测

Real-timequantitativePCRAmethodtomeasurethequantityofanucleicacidtargetusingthePolymeraseChainReaction(PCR)ThePCRamplificationreactionismonitoredineverycycleasithappens(i.e.“inreal-time”)ThetargetmaybeDNAorRNA（CDNA)

1.荧光扩增曲线分成三个阶段：

荧光背景信号阶段

荧光信号指数扩增阶段

平台期2.△Rn一个反应管经n次热循环后，测得的荧光强度3.Baseline

是背景曲线的一段，范围从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景

4.threshold荧光阈值

荧光（Rn）超过本底时的临界数值,在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍

5.CT（cycleofthreshold）

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数

荧光定量分绝对定量和相对定量每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表Ct值因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。绝对定量

主要针对样本间基因表达的差异，比如说经过处理的样本和未经处理的对照。因为不要做标准曲线，基因表达的相对变化分析比绝对定量的方法更省时，应用更广泛。需要内标基因做归一化处理。标准的看家基因一般都可被用作内标基因。如GAPDH，β-actin,β2-microglobulin以及rRNA等。在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因表达不会受实验处理的影响。相对定量内标基因的选择检测样品间表达一致基因选择时应考虑组织，时期，以及处理方法引起的差异多基因同时反应时内标基因表达量应高于目的基因相对定量相对定量的计算方法相对定量的计算方法定量一般是在PCR扩增的指数期进行的PCR指数扩增的公式是：Xn=X0×(1+EX)n

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