低聚异蔗糖对模拟失重大鼠肠道益生菌的影响

低聚异蔗糖对模拟失重大鼠肠道益生菌的影响

国内外进行的大量研究表明，在航空航天轻微压力下和地面模拟丧失的条件下，身体中的钙含量大量丧失，导致一系列与钙代谢紊乱有关的疾病，如骨质疏松症、钙流动性障碍，并对运动员的健康构成威胁。因此,对于如何预防失重骨质丢失一直是航天医学研究的重点和热点,在进行机制研究的同时,人们也从多种途径包括膳食营养途径探讨预防和缓解这种现象的可能性。研究发现,非消化性寡聚糖能增加一些矿物质在体内的吸收和促进骨骼的矿化。非消化性寡聚糖的这种作用可能主要是由于它们所具有的益生元的特性所引起的。非消化性寡聚糖是低聚果糖、水苏糖和低聚异麦芽糖等的总称,它们经肠道益生菌酵解后,生成乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸,使肠道的pH降低,有助于钙的溶解和吸收。业已发现在航天飞行期间,航天员肠道益生菌数量减少,出现肠道微生态失调的现象。本试验研究的主要目的是观察低聚异麦芽糖对模拟失重大鼠的钙代谢和骨丢失是否具有有益的影响,并探讨可能的作用机制。1大鼠粪便中活菌集落的测定1.1动物分组及喂养SPF级SD雄性大鼠(由北京动物实验中心提供)30只,体重(120±10)g,随机平均分为3组:FC组:正常对照组,自由活动;SC组:模拟失重对照组。FC、SC两组大鼠进食SPF级普通饲料。SS组:模拟失重低聚异麦芽糖组,进食在普通饲料基础上添加5%(W/W)低聚异麦芽糖(低聚异麦芽糖含量为50%~55%)。3组大鼠均单笼喂养,自由进食和饮用纯净水,实验期为21天。1.2模拟失重模型的建立大鼠尾部悬吊,后肢离地,使躯干与地面成25°~30°夹角,大鼠前肢着地,可以自由活动。1.3粪便标本采集及处理分别在实验开始后的第7天、第14天和第21天,用逼迫法取大鼠新鲜粪便,求得粪便重量,以1ml生理盐水稀释后,震荡器上震荡混匀,然后用生理盐水以10倍稀释的比例稀释成系列。1.4培养基的选择和制备厌氧培养基(TPY、MRS)按熊德鑫的要求制备。1.5接种取上述处理的标本系列稀释液0.01ml接种到选择性和非选择性培养基上,分别置于厌氧培养箱中培养48h后观察结果。清点菌落数并鉴定菌株。1.6血样采集于实验的第20d晚开始禁食12h,次日用2%的戊巴比妥钠盐溶液麻醉大鼠后,腹主动脉采血。室温下放置1h后,离心(3000mp×45min)分离血清。1.7血清钙的测定采用血清钙检测试剂盒(北京朗道医疗用品有限公司),用比色法测定。1.8血清骨钙素的测定用放射免疫法测定血清骨钙素的含量,骨钙素试剂盒由北方放射免疫试剂研究所提供。1.9骨密度测定大鼠处死,将大鼠后肢右侧股骨取出并剔净附着软组织,用浸透生理盐水的纱布包裹,检测前去掉纱布,将样本置于DPL+型双能X射线骨密度检测仪(美国LUNAR公司)上测定。1.10粪钙和骨钙的测定股骨标本的处理:将骨密度测定后的股骨置于马弗炉中灰化,灰化后称重。将灰化后的股骨置于50ml容量瓶中用2%盐酸溶解后定容备检;在实验开始的第16、17、18d连续收集3d大鼠粪便,然后将粪便放入烤箱中120℃烤至恒重,取0.1g的干粪便置于50ml容量瓶中加40ml的2%盐酸,置于摇床中220r/min震荡2h,定容后静置过夜备检。用EDTA滴定法测定钙量,钙红做指示剂。1.11计算及统计分析(1)饲料钙表观吸收率(%)=(平均每日钙摄入量-每日粪钙排出量)/平均每日钙摄入量×100%。(2)每克粪便中的活菌集落对数值(CFU/g)=log[标本重量(g)+稀释液量(ml)]/标本重量×稀释倍数×菌落个数×102。用均值±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示结果,Excell统计分析程序对结果进行t检验。2尾吊大鼠股骨钙、骨钙和粪钙检测2.1SC组大鼠粪便标本与SS组粪便标本益生菌(双歧杆菌和乳杆菌)菌群检测结果如表1所示。2.2各组大鼠不同时间内粪便菌群检测结果的分析列于表2中。2.3大鼠骨密度测定结果见图1。由图可知,悬吊3周后,SC组大鼠股骨骨密度显著低于FC组(P<0.001),而SS组大鼠股骨骨密度显著高于SC组(P<0.01)。2.4血钙、骨钙和粪钙检测结果2.4.1血钙检测结果见图2。悬吊21d后SC组大鼠血清钙浓度高于FC组(P<0.05)。SS组大鼠血钙浓度低于SC组(P<0.05)。2.4.2骨钙检测结果见图3。FC组和SS组大鼠股骨钙的含量均显著高于SC组(P<0.05)。表明尾吊大鼠股骨骨钙出现大量丢失,低聚异麦芽糖具有减轻骨钙丢失的作用。2.4.3大鼠饲料钙的表观吸收率检测结果见图4。SS组大鼠饲料钙的表观吸收率为48.2%,SC组为41.6%,二者相比差异具有显著性(P<0.01)。2.5血清骨钙素含量的测定结果见图5。由图看出,SC组骨钙素浓度低于FC组(P<0.05),说明悬吊使大鼠的骨转换率降低,骨丢失为低转换型;SS组骨钙素水平明显高于SC组(P<0.05)。3低聚异麦芽糖对模拟失重大鼠血清bgp的作用目前国内关于微重力条件下肠道菌群变化的研究刚刚起步。而肠道菌群作为人体数量最大,种类最多的细菌库,尤其是其中的益生菌的数量和比例对人体具有十分重要的生理意义。本实验采用尾吊大鼠的方法模拟失重,研究结果表明模拟失重条件下,双歧杆菌的数量显著减少(3次检测的结果P值均小于0.0001),乳杆菌数量也明显降低,这与美国生物卫星上观察到的结果相一致;在模拟失重条件下,导致大鼠肠道益生菌数量减少的确切原因尚不清楚,推测与模拟失重条件下消化道功能紊乱和免疫功能降低有关。低聚异麦芽糖是一种在体内仅部分被消化的碳水化合物,SS组大鼠肠道内双歧杆菌和乳杆菌的数量显著增加,表明低聚异麦芽糖具有明显的促进模拟失重条件下大鼠肠道双歧杆菌和乳杆菌增殖作用。从本研究的结果看,低聚异麦芽糖能够有效地减轻模拟失重大鼠股骨骨质丢失的作用,该作用可能与低聚异麦芽糖促进益生菌增殖有关。体现在:3.1通过益生菌间接增加成骨细胞的活性成骨细胞是骨代谢的主要功能细胞。血清骨钙素(boneglaprotein,BGP)由成骨细胞合成后,大部分沉淀于骨基质中,少量直接分泌入血液循环。目前认为BGP是骨有机质矿化的必要物质,由成骨细胞粗面内质网合成的BGP前体中的谷氨酸残基,必须经羧化生成ue160-羧基谷氨酸残基后才具有正常的生理功能,维生素K是这一羧化过程的重要辅酶。本实验的研究结果表明低聚异麦芽糖可以提高模拟失重大鼠的血清BGP水平,说明低聚异麦芽糖可以促进骨质钙化,这与维生素K防治骨质疏松作用结果相一致,其作用机制可能是通过维生素K的作用途径实现的,由于体内的维生素K主要靠肠道中的益生菌合成。前已述及:模拟失重条件下,大鼠肠道益生菌数量明显减少,由此造成维生素K合成量减少,这可能是模拟失重组大鼠血清BGP含量低的原因之一。并且实验发现低聚异麦芽糖能促进肠道益生菌的增殖,所以推测低聚异麦芽糖提高模拟失重大鼠血清BGP水平可能是通过促进肠道中益生菌的繁殖进而合成维生素K而起作用的。3.2可促进膳食钙的吸收和利用非消化性寡聚糖(NDOS)能刺激一些矿物质的吸收并促进骨骼的矿化,NDOS功效评价的动物实验表明,NDOS能增加钙、镁、锌和铁等矿物质的利用率,NDOS的这些作用可能主要是由于其所具有的益生元特性导致的。NDOS刺激矿物质吸收的可能机制主要有:(1)NDOS通过小肠进入盲肠和结肠后被存在于结肠的一些益生菌主要是双歧杆菌选择性发酵生成短链脂肪酸(SCFAS),pH降低,从而有利于肠钙的溶解和吸收。(2)绒毛隐窝高度、每个隐窝上皮细胞数量和盲肠静脉流量以及黏膜-浆膜钙的流出(钙被动转运途径)等都因NDOS的作用而增加。(3)NDOS刺激钙结合素(calbindin)-D9K的表