环境微生物群落的荧光原位杂交分析

环境微生物群落的荧光原位杂交分析

在传统的微生物研究中，对自然环境中微生物的认识和了解主要基于传统的培养方法，如微电图法、活细菌数法（cfu法）和最大可能数法（pmn法）。但是通过研究,人们逐步认识到,自然环境中绝大多数(99%以上)的微生物种类是不能通过人工培养获得的,这就给微生物的分析和研究工作带来了极大的障碍。目前,微生物学和环境科学研究工作者们,都一直在寻找和探索一些新的分析方法来解决这些问题。随着近代分子生物学技术的发展,不依靠纯培养的微生物群落结构的分析方法已得到广泛发展和应用。近年来,针对目前传统微生物分析方法存在的问题,在环境微生物领域,国际上诸多国家先后开展了分子生物学研究方法的建立和生物学评价工作,更精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性。目前在微生物生态学研究中常用的方法有:核酸探针杂交技术、DNA直接测序、rRNA序列同源性分析方法和梯度凝胶电泳方法等,使微生物生态学研究有了重大突破。1988年,Giovannoni将原位杂交技术引入了细菌学的研究中,他首先用放射性标记rRNA寡核苷酸探针显微探测细菌。随着安全性较强的荧光技术的发展,1989年,DeLong首先用荧光标记的寡核苷酸探针来探测独立的微生物细胞。此项技术即荧光原位杂交(fluorescentinsituhybridization,FISH)技术,由于它安全、方便、实用,从而在环境微生物监测中得到广泛应用。通过在环境样品上直接原位杂交,不仅可测定不可培养微生物的形态特征及丰度,而且可原位分析它们的空间及数量分布。德国慕尼黑大学的Amann教授在环境微生物FISH技术研究中,进行了大量深入详尽的工作。Wagner、Manz及Luxmy,在此方面特别是在污水处理中对微生物的种群原位监测投入了大量的精力,对不同城市污水处理厂混合液样品的微生物种群进行荧光探针原位检测,发现beta-亚纲的变形细菌所占比例最高,其次是Cytophaga-flavobacterium菌群和高G+C含量的革兰氏阳性细菌,而gamma亚门的变形细菌所占比例较低,在10%以下。最近,随着这些研究工作的开展,一些分子生物学研究分析技术,其中特别是简便、实用的FISH技术,正在环境科学研究工作中逐渐被广泛应用。本文将在简述FISH技术基本原理的基础上,对FISH技术在废水生物处理微生物生态学检测中的应用研究状况进行介绍。1fish技术介绍1.1检测16srrna的探针设备细菌细胞内核糖体数量达104~105,核糖体RNA(rRNA)有特异区和高度保守区,对物种的进化有指示性作用,被称为微生物体内的“活化石”。核糖体内的16S-rRNA的序列是最理想的用于基因分类的靶序列。因为16S-rRNA分子结构上高度保守,只有某些位置有少量核苷酸序列的改变,而这些位置的改变具有种属特异性。另外,它信息较多,且长度适中,约1500bp。所以根据16srRNA序列的保守性和特异性可设计所需要的不同分类级别的寡核苷酸探针。所谓核酸探针是指,能识别特异核苷酸序列的带标记的一段单链DNA或RNA分子,只与被检测的特定核苷酸序列结合,不与其他系列结合。对微生物探测的FISH技术中使用的16(~23)S-rRNA寡核苷酸探针,一般是进行了荧光标记20bp左右的特异性核苷酸片段上。利用该探针与固定的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交。分子杂交是DNA的变性和与带有互补的同源单链退火配对形成双链结构的过程。而上述过程并不需要DNA或RNA的提纯、扩增等繁琐步骤,实用性较强。1.2载玻片的制备该技术主要操作步骤包括:(1)活性污泥的预处理:革兰氏阳性细菌用50%乙醇溶液,革兰氏阴性细菌用4%多聚甲醛处理;(2)样品在载玻片上固定并用乙醇脱水;(3)寡核苷酸探针杂交:一般在46℃下杂交1~3h;(4)样品清洗:用48℃水浴的清洗液及冰浴的超纯水清洗;(5)封片观察。通常要结合使用一些通用的寡核苷酸探针对微生物样品进行区域界定及不同分类级别的区分。如EUB338探针是细菌的通用探针,DAPI染色可作背景来界定生物体细胞的区域。并结合其他特异性探针,选择不同颜色的荧光标记,同时,进行荧光原位杂交。2原位杂交技术微生物是废水生物处理过程中的作用主体,通过新陈代谢过程,具有分解和矿化有机物的能力。处理系统中微生物的一般存在方式为活性污泥和生物膜。研究并阐述活性污泥及生物膜微生物生态系统的组成、结构与功能,对于进一步了解微生物种群之间的相互关系,以及微生物群落结构与处理效率的相关性及其工程调控,进一步提高微生物对有机污染物的降解能力,提高废水的生物处理效率具有重要的理论和实用意义。传统的培养法由于具有客观的局限性,不适合对污泥生态结构及物种组成进行全分析。FISH能够克服传统方法上微生物分离培养的困难,同时,也避免了其他分子生物学方法的烦杂的过程,可准确快捷地反映出各种处理系统中微生物群落的原位分布,是研究环境微生物群落结构的较佳工具。原位杂交技术相关研究结果充分证明了上述观点:原位杂交发现氨氧化菌Nitrospirspira广泛分布在各种环境中,而Nitrosomonas却很少在环境中监测到,而实验室传统培养得出的结果却相反。FISH技术可利用网式探针杂交法层层筛选复杂的共生体,对所关注的优势菌株进行动态的半定量监测。德国学者Wagner对8个污水处理工艺(以生物除磷为主)的生物多样性进行了FISH探测。平均看来,其中α-亚纲变型细菌占细菌总数的11%,β-亚纲变型细菌占细菌总数的29%,其中γ-亚纲变型细菌占细菌总数的10%,δ-亚纲变型细菌占细菌总数的2%,ε-亚纲变型细菌占细菌总数的4%,Bacteroides细菌占细菌总数的14%,放线菌占细菌总数的7%,硝化细菌Nitrospira占细菌总数的2%。表1为废水生物处理中常用的高分类级别探针。表2为标记探针的常用荧光标记素及相关内容。2.1fish检测硝化菌和氨氧化菌的数量及空间分布与微生物硝化循环中所处的阶段相关。对处理系统中硝化菌及氨氧化菌的研究,是调控工艺运行的重要参数。由于硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧菌,传统的研究方法存在着缺陷。传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定步骤,耗时长(4~8周),而且,因为所用的培养基有选择性,使得某些易于培养的菌株如Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterwinogradskyi等超过了其他硝化细菌,在培养基中处于竞争优势,因此得到的优势类群与样品中的真实情况有差异;而且,传统的方法对培养困难的硝化菌无法进行研究,FISH技术的引入解决了上述困难。Wagner和Bruce等较早将FISH技术应用于硝化细菌检测,他们研究了一套较完善的对硝化细菌检测的FISH技术,后来随着人工设计合成的硝化细菌及氨氧化菌探针的不断推出,FISH技术被广泛地应用于活性污泥系统、硝化流化床反应器和膜-生物反应器等污水处理系统中。Juretschko和Schramm等曾对硝化流化床、普通活性污泥等工艺的活性污泥中硝化细菌的多样性采用FISH法进行了跟踪分析,发现Nitrosospira、Nitrospira为优势菌种,而并未探测到Nitrosomonas和Nitrobacter。在Juretschko对多个工业废水处理厂利用活性污泥工艺处理工业废水的探测中发现,属于变形细菌β-亚纲的Nitrosomonas氨氧化菌占DAPI染色的总菌数的16%~20%;用探针S-*-Ntspa-1026-a-A-18探测到的Nitrospira硝化细菌占细胞总数的9%。一般硝化细菌FISH检测的常用探针如表3所示。图1是常用硝化细菌进化亲源关系进化系统。2.2酶活性污泥中的细菌脱氮除磷工艺在废水处理工程中被广泛应用,特别是强化除磷(EBPR)工艺,对污水除磷效果十分显著。近年来,国内外许多学者利用分子杂交技术对不同除磷工艺中聚磷菌的生态变化进行了大量研究,其中台湾大学的刘文涛、Alex等、Christina和Mino等。FISH技术的应用克服了以往除磷菌难于用常规方法培养造成的研究上的困难,并对不同条件下生物除磷工艺的改进起到了指导性的作用。Mamoru对除磷工艺的FISH研究中,使用ALF1b、HGC和Bet42a探针检测出的细菌量所占比例较大,分别在10%~64%,MP2和CF探针探测到的细菌含量并不高,在4%以下。在强化除磷(EBPR)工艺中,无论好氧或厌氧区的活性污泥中都存在着大量丰富的除磷微生物,其中常见类群为BetProteobacteria亚类的Actinobacteria菌、GPBHGC、Epbr15和Epbr16等。近期报道的Rholocyclus也是生物除磷的优势种群,并且利用常规培养方法不能培养的γ-亚纲变型细菌也在EBPR工艺中探测到。现今在污水生物处理的生物学相关研究中,结合分子生物学领域变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,对活性污泥中混合微生物提取基因进行电泳分离,经测定其基因序列后,现已设计出一些探测常见除磷细菌的生物学探针(表4)。图2是对活性污泥中除磷菌进行FISH探测后的照片(a)与相应光学照片对照(b)。其中白色圆环内是与被黄色荧光素标记(文中浅色位置)的Rhodocyclus-like除磷菌探针结合的除磷菌。充分显示了该技术在除磷菌研究中的直接和高效性能。2.3生长阶段研究进展在污水生物处理工艺系统内,丝状微生物的大量滋生是引起污泥膨胀的主要成因。一些种类的丝状菌大量增殖,严重影响活性污泥的沉降性能造成污泥膨胀,将导致系统整体的处理能力和处理效率下降。资料整理发现,这些丝状菌类群主要包括丝状真菌、放线菌和丝状细菌3大类,其中具体包括有:亮发菌属(Leucothrixcohaerens)、诺卡氏菌属(Nocardia)、球衣菌属(Sphacrotilus)和发硫菌属(Thiothrix)等微生物类群。Eikelboom利用传统的分离和培养方法对丝状菌做了大量的研究:他从膨胀的污泥中采集到1100个样品,分离出26个典型的丝状菌,其中大多为丝状细菌,通过研究总结出一套可行的传统鉴定分类方法。所以一直以来沿袭下来的传统分析方法通常是在显微镜下直接观察,粗略地进行分析。但是,用传统的方法对丝状菌进行鉴定过程中,在菌体的培养问题上遇到了较大的困难,尽管丝状菌在发生膨胀的活性污泥中客观存在,但由于其对培养基的选择性很强,所以不易进行实验室分离培养,也就更加难以进行其生态学分析。基于分子生物学实验技术发展和应用,人们利用FISH技术使该问题得到了较好的解决,Francis等、Peter、Linda等、Wagner和Kanagawa等对活性污泥中丝状微生物作了大量的FISH鉴定工作,从探针的设计及应用等方面作了详尽的阐述。FISH技术的应用对深入认识丝状微生物膨胀机理提供了大量有用的信息。从前人们认为,丝状微生物膨胀受放线菌细胞的霉菌素升高影响。但是近期FISH检测结果表明,在好氧及厌氧消化膨胀的活性污泥中,放线菌目Mycobacterrium菌群含量占15%~18.3%,其中主要是Gordona菌。Liu和Seviour则利用FISH技术对Nostocoidalimicola进行了大量的分类研究工作。近年来,人们经过对活性污泥中常见丝状菌的研究,开发出的一些主要的丝状微生物探针,经整理列为表5。3生物处理工艺监测和分析的应用FISH技术在国内外微生物群落解析工作中已得到较为广泛的应用,技术水平日趋成熟。10余年来,一些科研工作者将该技术初步应用于环境科学研究中,这些研究工作取得了较好的结果,揭示了FISH技术在环境科学领域内应用的可行性和实用性。FISH技术的主要原理是利用rRNA并结合其他分子生物学研究方法,突出特点是可以克服纯培养的技术限制,可以在原位水平进行探测和分析生物处理工艺系统中微生物群落的组成及演替,以及不同种群的空间联系等生态学变化规律。尽管FISH技术应用于环境微生物监测中还存在一些