荧光原位杂交技术在微生物群落研究中的应用

荧光原位杂交技术在微生物群落研究中的应用

在许多微生物生态学、微生物诊断和环境微生物的领域，需要一种快速、特异性的检测方法。但是常规的培养基培养方法通常费时费力,尤其对于选择性高、营养需求复杂或目前为止无法培养的微生物种类,无法实现快速的培养和有效的检测。基于此,近年来国内外诸多学者先后开展了分子生物学方法的建立及生物学评价工作,从而更快、更精确地揭示微生物的种类和多样性。目前常用的分子生物学方法包括基于PCR的核酸技术(PCR-RFLP,PCR-SSCP,PCR-DGGE,RT-PCR等),DNA直接测序等。然而这些方法无法提供微生物形态学、空间分布和生物体的细胞环境等信息,并且PCR对环境样品分析存在一定的偏差。荧光原位杂交(FluorescenceInSituHybridization,FISH)技术结合分子生物学的精确性和显微镜的可视性,可进行微生物的空间分布情况分析和特征性微生物的鉴定与定量分析。1989年,DeLong首次将荧光标记寡核苷酸探针应用于检测单个微生物细胞,开创了应用于微生物生态学的先河。由于该法操作容易、安全、检测迅速,目前已广泛应用于环境微生物生态学和食品学等领域,成为研究微生物群落最具生命力的技术之一。1荧光原位杂交荧光原位杂交技术由原位杂交技术(InsituHybridization,ISH)发展而来,其间经历了放射性标记探针和荧光标记探针2个阶段。最近10a,荧光原位杂交技术已成为鉴定环境微生物的一个标准方法。荧光原位杂交技术的原理是dsDNA变性后和带有互补序列的同源单链退火配对形成双链结构的过程。退火复性形成的可以是双链DNA或DNA/RNA异质双链分子,带有荧光标记的探针与固定在玻片或纤维膜上的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交,探测其中所有的同源核酸序列,结果可直接在共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜下观察,无需单独分离DNA或RNA。此技术包括如下步骤:样品固定、样品的制备与预处理、预杂交、探针和样品的变性、杂交、漂洗和检测信号等。下面简要介绍FISH技术中的4个关键环节:探针与标记、荧光染料、FISH的靶序列、杂交。1.1荧光标记法FISH所采用的探针必须具有特异性强,灵敏度高,良好的组织渗透性。一个典型的寡核苷酸探针长度一般是15~30bp。标记的方法一般有以下几种:①直接荧光标记,通过荧光素与探针核苷或磷酸戊糖骨架共价结合,或是掺入荧光素-核苷三磷酸,一个或更多荧光素分子直接结合到寡核苷酸上,在杂交以后直接检测荧光信号。它是使用最普遍,最简单,最快,最便宜的标记方法;②间接荧光标记,是指将标记物(如地高辛、生物素)连接到探针上,然后利用偶联有荧光染料的亲和素或抗体进行检测的方法。荧光素-异硫氰酸(FITC)通过18-C间隔物偶联到寡核苷酸与直接连接到探针上相比可以增加荧光信号。1.2背景染料的检测由于不同的荧光染料通常具有不同的激发和散射波长,因此可以同时观察两种或更多的微生物。为了清晰地同时观察两种以上的微生物,就需要多波峰的滤镜及要求荧光染料具备狭窄的散射峰,以免探针之间光谱的重叠。常用的荧光染料有荧光素衍生物(FITC、FluoX)、罗丹明衍生物(TRITC、TexasRed)和吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)等,而吲哚二羧菁与前者相比具有亮度高和光熄灭稳定性。背景染料可以用DAPI,来界定生物体的细胞区域。Davenport等用TRITC标记mycolata菌种探针和用FITC标记细菌通用探针,从而来定量每毫升样品中mycolata细胞数量。Liao等用Cy3标记的S-S-S.nat-0656-a-A-18探针进行杂交,在显微镜下,S.natans细胞显红色,把DAPI作为背景染料,使所有的细胞显蓝色,从而对接种于完全混合反应器中一天后的S.natans细胞进行定量。1.3种属鉴定和定量鉴定在微生物学的研究中通常使用的靶序列是16SrRNA,这是由于细胞体内核糖体RNA(rRNA)量的丰富性,且具有特异区和高度保守区。因此可以根据rRNA目标区域设计探针,进行种属的特征性鉴定。近年来,还出现了应用核酸肽(PNA)探针的FISH技术对特征性微生物进行鉴定和定量的研究。Lehtola等应用PNA-FISH技术直接检测和鉴定生活用水过滤膜上的M.Avium和subsp.Avium。1.4fish的制备在保持细胞形态的条件下,进行细胞内的杂交与显色来分析DNA或RNA。包括以下步骤:①细胞的固定与处理:有效的细胞固定对于获得满意的FISH结果是至关重要的,而预处理就是要增加细胞组织的渗透性以及减少非特异性目标序列的结合。一般采用4%多聚甲醛固定,用蛋白酶K或HCl预处理;②杂交:这是FISH技术操作过程的核心部分。杂交一般在37℃到50℃,杂交时间为30min到几个小时;③样品的洗涤:用48℃水浴的清洗液及冰浴的超纯水清洗;④封片观察:即用共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜进行观察。2fish技术在微生物生态学中的应用FISH技术已经广泛应用于多种环境的微生物群落分析,分析的主要对象有人工创制微生物群落和自然微生物群落2大类。2.1采用fish技术的热反应FISH技术为人工创建生物处理系统的最佳工况条件提供了理论依据,并为提高相应的处理能力和处理水平提供了新的思路。Ercolini等用干酪中优势微生物的特异探针进行FISH杂交来研究完好干酪中的微生物群落,通过显微镜观察到其均匀分布于干酪中,且干酪悬浮液中存在不同形态微生物群落。据此可以通过观察微生物群落的分布情况来判断干酪的质量。Calli等在研究厌氧反应器里产甲烷菌的多样性时,用FISH技术成功的监控到随着氨浓度的提高,产甲烷菌呈现出更好的多样性,同时发现在极高的氨浓度下,Methanosarcina菌种非常丰富。Icgen等在连续厌氧反应器内处理含硫酸盐废水,用FISH技术研究了在不同硫酸盐负荷下,硫还原菌群落结构的转换。研究表明,在没有受到硫酸盐负荷冲击前,Desulfonema、Desulfobulbus和Desulfobacteriaceae是主要的硫还原细菌(SRB)菌种;当硫酸盐达到极高浓度时,Desulfobacter、Desulfotomaculum和Desulfovibrionaceae成为优势菌种。Ramsing等用荧光寡核苷酸探针检测了在光合生物膜上的硫还原细菌,分析表明SRB不是平均分布在生物膜上,而在缺氧层被严格限制。Eschenhagen等用FISH技术监控两个不同活性污泥系统微生物结构的变化以及根据特异探针推测聚磷菌的组成和分布,在试验中发现Tetrasphaeraspp.是主要的聚磷菌,但同时也观察到像Microlunatusspp和Rhodocyclusgroup其他的聚磷菌。Silyn-Roberts等应用FISH技术对废水处理湿地生物膜进行了研究,结果表明亚硝化单胞菌属是主要的氨氧化细菌。Neef等针对两种嗜温放线菌Saccharomonospora和Thermoactinomyces,用FISH技术快速鉴定和直接观察了在堆肥挥发物中的这两种菌,从而实现了对堆肥过程的有效监控。Hiraishi等用FISH技术研究用花盆废物作为序批式反应器启动原料进行家庭生物垃圾堆肥中微生物群落的变化,发现在启动阶段组成微生物群落的主要菌类从Proteobacteria变化到Actinobacteria。2.2nobacteria的菌属FISH技术为复杂自然环境样品提供一种鉴定和定量微生物以及了解微生物群落动态变化的方法。Warnecke等用FISH技术对沿同一海拔梯度的10条山地河流(水面受到紫外线照射)中的微生物组成进行了研究,发现Actinobacteria和β-proteobacteria是主要菌种;并鉴定了Actinobacteria的菌属,分析表明来自acI分化枝不同世系的Actinobacteria组成了河流的微生物群落。Girguis等将从深海沉积物中厌氧富集培养的古菌,用FISH技术对其进行鉴定。依靠传统方法对水体中亚历山大藻进行监测很难奏效,然而Sako等用FISH技术快速且成功的检测到了亚历山大藻(有害藻类),可以及时地防止赤潮问题。Kobabe等用FISH技术分析了永久冻结层上溶化层微生物的组成,研究发现在不同的地平线上,细胞量和活性微生物的组成是完全不同的,从表层到底部的每千克干土壤中细胞数从2.3×109个减少到1.2×108个,这是由于垂直分布生态系统环境条件不同所引起的。Watt等用FISH技术分析了生长小麦根系的土著细菌、假单胞菌、丝状菌的量以及分布情况。空间分析表明细菌在根部表面(2~30μm范围)11μm之内处于稳定的状态,40%在根部丛生。定量分析表明在小麦根系细菌平均细胞量为15.4×105cells/mm3,假单胞菌、丝状菌的量分别占总菌数的10%和4%。3fish的缺点和解决方案3.1探针的特异性分析:点交互作用、个案研究和背景荧光在FISH检测中,寡核苷酸探针的特异性决定了检测结果的可靠性和精确性,所以通常希望设计得到的寡核苷酸最好与数据库中的寡核苷酸一样的精确。现存数据库的不断扩大和所报道序列的非精确性,探针序列的检测最好用最常规、最新版本的序列数据库进行校对。而对于一些培养条件苛刻的和暂时无法培养的微生物,应该用点杂交的方法分析探针的特异性,来确定探针设计的合理性。此外,一些微生物本身具有荧光性,会对FISH检测产生干扰。虽然自身荧光性有利于复染,但经常降低信噪比,同时掩盖特异的荧光信号。所以在处理一些混合菌群时要防止自身背景荧光的处理。使用狭窄波段的滤镜和放大系统以及适当的预处理,可以降低背景荧光。Lin等发现用H2O2预处理可以有效的减少假阳性。Taguchi等在使用FISH之前,用HCl预处理可以减少来自荧光标记寡核苷酸探针非特异性吸收的背景荧光以及减少大量的杂质。Hahn等发现用地高辛标记探针原位观察Frankiastrains与用荧光标记探针相比,不产生自身荧光问题。3.2荧光探针和多核苷酸探针的杂交虽然大多数细菌含有高的rRNA丰度,但rRNA丰度变异不仅仅发生在种属间,亦发生在同一菌不同生长阶段,生长率慢的细菌含有低的rRNA丰度;有些微生物细胞壁渗透性差,使探针不能充分进入细胞内与rRNA分子杂交,这些都将导致假阴性结果。因此,优化渗透性、用高亮度的荧光染料Cy3或Cy5和多重探针标记,应用信号放大系统或多核苷酸探针和CARD-FISH均可以增加杂交信号。Watt.等用FISH技术分析生长小麦根系的土著细菌、假单胞菌、丝状菌的量以及分布情况时发现使用Cy5或Cy5.5荧光染料可以避免在观察时看到自身荧光。一些研究发现用多核苷酸荧光杂交技术和CARD-FISH均可以发现在水体中丰富的古生菌,而寡核苷酸荧光杂交技术无法发现,表明寡核苷酸荧光探针的杂交信号较弱,通过其方法的改进,可以消除实验结果的假阴性。Schönhuber等发现用CARD-FISH比单荧光标记的FISH荧光信号强20倍。4堆肥微生物生态学FISH技术在污水处理系统、湿地、湖泊、植物根系等环境领域都得到了广泛应用,而应用于堆肥过程却末见报道。目前传统的微生物分离及鉴定技术只能得到堆肥样品中微生物群落的一小部分(小于1%);脂肪酸谱图法(PLFAs、WCFA-FAMEs等)和醌指纹法(QuinonesProfiling)都不能反映堆肥过程中具体哪个属或哪个种的变化。相较之,FISH技术可以检测出个体微生物的原位生理特性和功能,并实现在种属水平上跟踪堆肥过程中所有重要菌群的变化、演替规律,为堆肥技术和工艺的研究提供理论基础。FISH技术也有其无法提供的微生物信息,必须与其他技术结合可为环境微生物生态学研究提供更多的信息:①在堆肥和污水处理系统中荧光定量-聚合酶链式反应(RTQ-PCR)与荧光原位杂交(FISH)技术结合能更好地揭示优势菌种数量变化与空间分布;②在堆肥处理过程中FISH技术与流失细胞仪相结合,评价和分析堆肥化过程的微生物群落结构和动态变化,用以指示堆肥腐熟度;③活性污泥絮体或生物膜中特异化