survilinmrna及hpv1618与宫颈癌的相关性研究

survilinmrna及hpv1618与宫颈癌的相关性研究

肿瘤的发生、发展和恶化是一个多基因、多因素、多阶段的过程。研究表明,宫颈癌的发生、发展与人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染和细胞凋亡的调控有密切关系。Bcl-2基因是最早发现的细胞凋亡抑制基因,是迄今研究最深入、最广泛的凋亡调控基因之一;而Survivin是至今发现抗凋亡作用最强的基因。本研究采用原位杂交法在核酸水平检测正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌中SurvivinmRNA及HPV16/18DNA的表达,同时采用免疫组化法在蛋白水平检测Bcl-2的表达。研究Survivin基因在宫颈癌中的表达及与Bcl-2、HPV16/18的相互关系,探讨三者与宫颈癌的相关性。1数据和方法1.1病例对照分析收集2006年1月至2008年3月因CIN或宫颈癌在我院就诊患者的病理标本155例,临床资料均较完整。其中CIN组74例(CINⅠ级13例,CINⅡ级26例,CINⅢ级35例),宫颈癌组81例(70例鳞癌,11例腺癌);另取20例正常宫颈组织(包括宫颈良性病变)作对照组。根据2000年国际妇产科联盟(FIGO)分期标准进行宫颈癌临床分期:ⅠA期9例,ⅠB期17例,ⅡA期33例,ⅡB期12例,Ⅲ期10例。按组织病理学分级:高分化14例,中分化29例,低分化38例。按照肿瘤生长类型分为:外生型39例,内生型15例,溃疡型16例,颈管型11例。81例宫颈癌患者中54例行广泛性子宫切除术加盆腔淋巴结清扫术(包括ⅠA期3例、ⅠB期17例、ⅡA期33例、ⅡB期1例),有淋巴结转移者21例,无转移者33例。患者年龄19~78岁,平均40.06岁。取材前均未接受任何其他治疗。1.2ccrtcacdacca基因回复性分析Survivin原位杂交检测试剂盒(购于武汉博士德生物技术有限公司),针对人Survivin靶基因的mRNA引物序列为:①5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCA-3′;②5′-AAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCT-3′;③5′-AGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGG-3′。HPV16/18原位杂交试剂盒(购于福建泰普生物科学有限公司),鼠抗人Bcl-2多克隆抗体和免疫组化试剂盒(即用型二步法)(购自北京中杉生物技术公司)。1.3方法1.3.1样品处理所有标本及时以4%多聚甲醛(含有1/1000DEPC)固定,石蜡包埋,4μm连续切片。1.3.2msna核酸片段的制备切片脱蜡脱水,滴加新鲜配置的0.5%H2O2,室温处理30分钟;滴加3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶,37℃消化以暴露SurvivinmRNA核酸片段;滴加预杂交液,恒温箱恒温42℃4小时;滴加杂交液,恒温箱42℃过夜;梯度SSC洗涤,依次滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC,DAB显色、复染、透明,封片镜检。以不加Survivin探针只加预杂交液作为阴性对照。1.3.3免疫总免疫法检测人单克隆抗体采用免疫组织化学染色(即用型二步法):石蜡包埋组织切片常规脱蜡脱水后,微波修复抗原,经内源性过氧化酶(3%H2O2)阻断剂孵育10分钟,PBS液冲洗。加Bcl-2鼠抗人单克隆抗体(稀释度1∶50),4℃冰箱过夜。PBS冲洗后加入即用型二抗PV-6000,37℃孵育20分钟,PBS冲洗,常规DAB显色,苏木素复染、透明,封片镜检。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照,用已知阳性片作阳性对照。所有切片均在相同条件下进行。1.3.4生物素化探针切片脱蜡水化,加蛋白酶K,37℃孵育18分钟;梯度酒精脱水。每张切片加入10μl的生物素化探针,并盖上盖玻片。95℃变性10分钟,37℃下湿盒中杂交10小时,去垢剂洗涤液浸片15分钟去盖玻片。加SPAP结合物,37℃孵育25分钟,加酶底物BCIP/NBT室温暗盒显色15分钟。核固红复染,水性封片剂封片。1.3.5阳性细胞数法检测所有切片采用双盲法由两位有经验的病理科医师阅片。参照Kawasaki等的半定量积分法判断结果:光镜下,Survivin和Bcl-2阳性表现为细胞浆中出现淡黄色至棕黄色颗粒。随机观察10个高倍镜视野,按每高倍镜视野阳性细胞数百分比记分:阳性细胞数小于5%为0分,5%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,大于75%为4分。按着色强度记分:染色呈淡黄色者记为1分,染色呈黄色者记为2分,染色呈棕黄色者记为3分。两种记分的乘积即为阳性强度:0分为阴性(-),1~4分为弱阳性(+),5~8分为中度阳性(++),9~12分为强阳性(+++)。HPV16/18DNA阳性细胞表现为细胞核中出现蓝色或黑色颗粒。1.4博弈情境下fisher准确性检验采用SPSS13.0软件进行分析。率的比较采用χ2检验(四格表或列联表)或Fisher精确概率法,两者相关性采用Spearman等级相关分析,设定P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有高度统计学意义。2药代动力学及组织学检测2.1Bcl-2在3种组织中的表达Bcl-2阳性定位主要在细胞浆,呈淡黄色或棕黄色颗粒,见图1(见插页1-1)。由表1可见,Bcl-2在宫颈癌组和CIN组的阳性率明显高于对照组(P=0.000),宫颈癌组又明显高于CIN组。由表2可见,随着宫颈癌临床分期和组织分化程度的升高,Bcl-2阳性率逐渐上升,差异有高度统计学意义(P<0.01)。而Bcl-2在有、无淋巴结转移及宫颈鳞癌、腺癌组织类型和肿块类型方面比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。2.2HPV16/18在3种组织中的表达HPV16/18DNA阳性细胞表现为细胞核中出现蓝色或黑色颗粒见图2(见插页1-1)。在对照组、CIN组和宫颈癌组中HPV16/18阳性率逐渐升高,差异有高度统计学意义(P=0.000),见表1。但HPV16/18的阳性率与CIN分级、组织类型、组织分化程度、临床分期、肿块类型及有无淋巴结转移均无关(P>0.05),见表2。2.3SurvivinmRNA在3种组织中的表达SurvivinmRNA在宫颈癌组织中以中度阳性(++)至强阳性(+++)多见,见图3(见插页1-1)。在宫颈癌组与CIN组的阳性率明显高于对照组,差异有高度统计学意义(P=0.000),见表1。随着宫颈癌组织分化程度和临床分期的升高,SurvivinmRNA阳性率逐渐升高(P=0.004,P=0.042)。Survivin在有淋巴结转移组的阳性率高于无转移组(P=0.006),但其在宫颈鳞癌与腺癌中的表达无差异,与肿块类型亦无关(P=0.461;P=0.844)。2.4Survivin高表达与HPV16/18感染及Bcl-2表达的相关性对175例宫颈组织SurvivinmRNA的表达率与高危型HPV16/18感染及Bcl-2的表达率进行等级相关分析,结果表明SurvivinmRNA高表达与HPV16/18感染呈正相关(P<0.05),SurvivinmRNA高表达与Bcl-2呈正相关(P<0.05)。3单次感染中创新点:自由基因实验宫颈癌的发生是一个多阶段、多步骤的复杂过程,与多种癌基因和抑癌基因的表达、调控以及细胞凋亡有关。Bcl-2蛋白主要定位于细胞膜的线粒体和粗面内质网上,其生物学功能为延长细胞的生命周期并增强细胞对凋亡刺激因素的耐受性而达到抗凋亡的作用,是较肯定的细胞凋亡调控基因。它在体内以二聚体形式发挥作用,若形成同聚体则抑制细胞凋亡。Bcl-2过度表达抑制细胞的凋亡,使受损的细胞获得永生性,并在增殖基因、生长抑制基因的共同调控下可发展为肿瘤。本研究发现Bcl-2在正常宫颈组织上皮细胞内(对照组)阳性率为5.0%,在CIN组中阳性率上升为39.2%,在宫颈癌组中达到70.4%,3组比较差异有高度统计学意义(P=0.000)。随着宫颈癌组织分化程度和临床分期的增加,Bcl-2阳性率有显著增加(P<0.01),表明Bcl-2与宫颈癌的发生发展有密切联系,其阳性与肿瘤的增殖、浸润相关。这与邓志敏等报道相一致。在宫颈非典型增生向宫颈癌演变的过程中,病毒整合是一重要机制,病毒的整合导致病毒基因表达的失调、宿主基因的不稳定、甚至细胞癌基因的激活,从而决定了细胞的恶性生物学行为。高危型HPV主要为16、18等亚型,其与宫颈癌发生发展密切相关。本实验研究结果显示,宫颈癌组的HPV16/18感染率显著高于CIN组和对照组,CIN组亦显著高于对照组。表明HPV16/18感染为宫颈癌发生发展的主要原因之一,其感染程度与宫颈病变程度相关,因此积极预防及治疗HPV感染对防治宫颈癌有重要意义。Survivin基因定位于17q25,主要通过直接抑制caspase-3和caspase-7的活性而阻断细胞凋亡过程。Survivin基因只在胚胎中表达,在成人已分化组织中呈低表达或不表达,但在人类多种肿瘤中都有表达,这一特点为肿瘤的早期诊断和基因治疗提供了新的靶点。Saitoh等用NorthernBlotting方法发现在大多数标本中,SurvivinmRNA在宫颈癌中的表达水平是正常宫颈组织的2倍。本研究发现在对照组、CIN组和宫颈癌组中Survivin的表达率逐渐升高,差异有高度统计学意义(P=0.000)。组织分化恶性程度越高、肿瘤期别越高,Survivin的阳性表达率越高,且淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组,以上结果说明SurvivinmRNA的表达与宫颈癌的发生发展有密切相关,它预示着肿瘤具有较高的侵袭性和不良预后。这与Kim等研究一致,提示Survivin可能通过抑制细胞凋亡、促进细胞增殖而在宫颈癌的发生发展中发挥作用。本研究中宫颈癌ⅡB期以上患者Survivin阳性率明显增高(P=0.042),亦提示Survivin表达与此类患者的不良预后有关,对临床治疗有指导意义。在本研究中尚未发现宫颈鳞癌与腺癌Survivin表达的差异(P=0.461),这可能与收集的宫颈腺癌样本量相对较少有关。由于本研究资料收集时间仅2年,尚缺乏研究对象生存时间的随访资料,Survivin是否为宫颈癌预后的客观指标还有待深入研究。本研究还发现Survivin的表达和Bcl-2呈正相关,其与HPV16/18感染亦呈正相关,目前3者协同致病机制还不清楚。可能是Survivin基因所在的染色体不稳定,此位点可能涉及t(14,18)易位,而导致Bcl-2基因转录激活;另一方面,通过相似的启动序列