乳腺癌组织中and-7microrna的表达状况

乳腺癌组织中and-7microrna的表达状况

近年来，发现了具有多基因调节功能的非编码小型脑浆肉，这在肿瘤的产生和发展中发挥了重要作用。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,相关microRNA的研究是当前的热点,现已取得更多新的进展。这些进展对于我们重新认识乳腺癌致病机制,诊断和靶向治疗乳腺癌都有重要启示。本研究以miR-let-7为靶基因,采用地高辛(Dig)配基标记探针的非同位素原位杂交技术,建立一种快速检测miR-let-7的方法,对乳腺癌组织进行检测,为以后探讨miR-let-7表达水平与乳腺癌发生的关系以及研究乳腺癌转移、复发和患者的预后打下实验基础。1材料和方法1.1断分型、分期及组织学分级依据取自我院手术切除女性乳腺癌标本35例。乳腺癌诊断分型、分期及组织学分级按照《恶性肿瘤诊治规范》标准进行。标本均经10%甲醛固定,石蜡包埋,5um厚连续切片,放置在多聚赖氨酸包被的载玻片上。1.2仪器恒温箱(意大利JOUAN公司),正立荧光显微镜(AxioimagerA1,德国ZEISS公司),摇床(常州澳华仪器有限公司)1.3抗地高辛抗体Let-7探针为Exiqon公司产品,3’末端标记试剂盒、抗地高辛抗体、NBT/BCIP为Roche公司产品,蛋白酶K为Merck公司产品,甘氨酸、绵羊血清、牛血清白蛋白、三乙醇胺、甲酰胺、乙酸酐和Tween-20均购于广州威佳公司。1.4实验方法1.4.1探针的制备a)用末端转移酶将LNA(LockedNucleicAcid,铆定核酸)修饰的探针的3′-末端标记上地高辛-ddUTP并将其配置成1uM.后放置在-20℃保存,b)标志反应体系:c)混匀后离心,37℃孵育15min后放置在冰上,d)加入2ul0.2MEDTA(pH8.0)终止反应,e)G25层析纯化探针。1.4.2dh2o-dh3o法a)二甲苯脱石蜡10min×2次,然后用梯度酒精脱水(100%,95%,80%,75%,每次5min),然后用双蒸水洗两次;b)将组织载玻片浸入0.2N的HCl内5min,PBS洗涤,40μg/ml蛋白酶K25℃消化20min,0.2%甘氨酸/PBS洗涤,PBS洗涤两次,用4%的多聚甲醛室温固定10min;c)PBS洗涤5min×2次,常温条件下用乙酸酐/三乙醇胺((6.25μl乙酸酐,5.2μlof12NHCl,and14μl三乙醇胺per1mlddH2O)处理10min,PBS洗涤5min×4次,5×SSC洗涤5min×2次;d)每张切片加预杂交液(60%甲酰胺,5×SSC,0.1%Tween-20,9.2mM枸橼酸,50μg/ml肝素,500μg/ml酵母tRNA,PH6.0)20μl,恒温箱49.5℃放置2h;e)吸取多余液体,加杂交液(2μl的探针放入100μl预热的杂交缓冲液),将盖玻片盖于切片上,恒温箱49.5℃过夜,1.4.3-溴-4-氯-3-哌磷酸二钠的合成a)杂交后揭掉盖玻片,5×SSC洗涤切片5min×2次,50℃条件下50%甲酰胺/2×SSC洗涤20min×3次,b)TBST(0.1MTrispH7.5,0.15MNaCl,0.1%Tween-20)洗涤切片5min×5次后,滴加封闭液(2%羊血清,2mg/ml牛血清白蛋白/TBST)封闭1h;c)甩去多余液体,滴加抗地高辛抗体(用封闭液稀释,1∶1000),4℃放置16h;d)用TBST洗涤切片10min×4次,染色液(100mMTris-HClpH9.5,50mMMgCl2,100mMNaCl,0.1%Tween-20)洗涤10min×2次,然后将新鲜配制的颜色反应缓冲液氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(NBT/BCIP)(1ml染色液,2.4μlof100mg/mlNBT,3.5μlof50mg/mlBCIP,1mMlevamisole)滴在玻片上,孵育4～48h,注意避光和防止干燥。e)将切片放入终止缓冲液(1×TEpH8.0)中终止反应后,显微镜观察细胞着色情况,拍摄照片。2阳性标本表达35例乳腺癌标本应用ISH共检出25例let-7表达阳性,阳性率为71.4%。阳性标本表现为肿瘤组织细胞多个细胞的胞浆呈现团块状紫蓝色着色(图1)。其中图a为阴性对照,图b为let-7阴性表达组,未见到蓝紫色的阳性表达产物,图c为let-7阳性表达组,在乳腺癌的细胞浆内可见到紫蓝色的阳性表达颗粒。对照组全部为阴性。3mir-15a和mir-16-1在肺癌患者中的表达乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,居女性恶性肿瘤中的第一位,近年来,乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势,发病年龄也明显年轻化,严重威胁着妇女的生命健康。而恶性肿瘤的形成和转移的发生是一个多基因、多因子共同作用的结果,探究肿瘤发生和转移的分子机理,寻找其相关的生物标志物是多年来肿瘤学基础与临床研究的主题之一。MicroRNA(miRNA)是一类新发现的内源性非编码小RNA分子,长度约为21-25个核苷酸,其主要功能为在转录后水平抑制基因表达。目前在动物与植物基因组中已发现4000多种miRNA,估计人类基因组中含1000种以上miRNA。它可通过两种机制中的任意一种调控靶基因的表达,一种是结合到靶mRNA的3UTR抑制其翻译,另一种是和siRNA一样,与靶mRNA结合,促进其降解。尽管这些miRNA的生物学功能及其靶基因仍不十分清楚,但可以确定他们调控着细胞分化、增值与死亡等复杂的生物学行为。最近三年来,已有文献报道microRNA的异常表达与特定的肿瘤具有相关性。例如在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中研究发现,miR-15a和miR-16-1存在缺失或下调,miR-15a和miR-16-1的表达与CLL中Bcl2的表达相反,这两个microRNA在转录后的水平上对Bcl-2起负调节作用。在白血病细胞系中已经观察到,含有9Bcl-2互补序列的miR-15a和miR-16-1,通过抑制Bcl-2蛋白表达,诱导肿瘤细胞凋亡。在结直肠癌中存在miR-143和miR-145表达异常。Calin等研究发现,miR15和miR16(定位于13q14)在慢性B淋巴细胞性白血病中常常缺失或表达下调,这与肿瘤发生中肿瘤抑制因子的作用相一致。肺癌存在let-7的表达异常并与预后相关。2000年Reinhart等首次在秀丽隐杆线虫(C.elegans)发育后期发现,一个执行线虫表型并改变其功能的miR-let-7。随后Johnson等在果蝇、D.melanogaster和人类等有机体内也证实了let-7的存在。由let-7家族编码的miRNAs是第一个被发现的可以调节癌症和肿瘤基因Ras基因表达的oncomirs。近期的研究表明let-7在肺癌和大肠癌中表达显著下调,let-7在翻译水平上抑制着RAS和c-MYC是许多肿瘤的共同通路,因此let-7可能是肿瘤发生的靶点。而Takamizawa等发现人的肺癌症和肿瘤中的let-7同源物的表达显著减少,并且这导致更差的预后。这些研究进一步说明let-7可以用于诊断,因为非小细胞肺癌症和肿瘤病人的let-7表达水平越低,其预后越差,术后生存期越短。体外组织培养实验表明,在人的肺癌症和肿瘤细胞中瞬时的增加let-7可以抑制细胞的增殖,这也说明let-7在肺组织中可能是一个抑癌症和肿瘤基因。因此,可以考虑使用let-7来治疗肺癌症和肿瘤。本课题组通过高通量MicroRNA芯片技术,发现具有抑癌特性的let-7在乳腺癌干细胞中的表达显著低于非癌干细胞;通过慢病毒载体携带let-7前体的表达序列,恢复该MicroRNA在乳腺癌干细胞中的表达,发现乳腺癌干细胞的“干细胞特性”被明显抑制,包括癌干细胞在体外和体内的自我增殖能力、多向分化和巨大的增殖潜能,以及在荷瘤鼠模型中的成瘤能力与肿瘤转移发生率均显著下降。大量研究表明肿瘤的远期复发和转移与肿瘤干细胞密切相关,let-7作为单种治疗方法或者与传统化疗、放疗相结合应用于乳腺肿瘤的治疗中,可能通过对肿瘤干细胞的调节干预而解决肿瘤复发的难题。另外,由于let-7在正常乳腺组织和其他分化的细胞中均有表达,外源性导入let-7对非肿瘤细胞的脱靶效应较小。ISH技术可将局限在某一类细胞中感兴趣的棱酸序列测出,从而显示出该序列在细胞或组织中的位置。这样,结合样品组织细胞的病理形态学变化,可大大有助于对疾