毒理学实验鱼品种和控制条件

毒理学实验鱼品种和控制条件

随着人类生产活动的发展，各种有害药物和因素不断进入环境，污染环境，对身体构成潜在威胁和损害。环境保护已成为人类密切关注的重大问题。环境毒理学是利用毒理学的方法,研究环境污染物对人体健康的影响以及致毒机理的学科,是环境医学的一个组成部分,也是毒理学的一个分支学科。通过研究环境污染物及其在环境中的降解和转化产物在动植物体内的吸收、分布、排泄等生物转运过程,阐明环境污染物对人体毒副作用的发生、发展和消除的各种条件和机理。研究环境污染物对人体的作用,除了直接通过流行病学和临床观察外,主要借助于动物实验,以阐明毒物的毒性、毒理作用、剂量等反应关系,确定阈剂量及最大无作用剂量,为制定卫生标准提供初步依据。用鱼类作实验动物是从20世纪60年代末至70年代初G.Streisinger建立斑马鱼(Brachydaniorerio)纯系开始的,到目前已培育出近交20代的纯系鱼类。无菌鱼类实验动物也在研究探索之中。选用鱼类进行试验研究,特别是进行毒理学试验,具有很多独特的优点。鱼类繁殖力强,世代周期短,如剑尾鱼(Xiphophorushelleri)7个月可达性成熟,稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)4个月可达性成熟。鱼类的遗传容易控制,一次产卵量大,如红鲫(Carassiusauratus)的怀卵量多达8万粒,且1年多次自然产卵。鱼类繁殖为体外受精、体外发育,卵径大,对胚胎易于进行观察分析,有利于人工繁殖、基因纯化和转基因鱼的培育。鱼类对水质的变化十分敏感,只要水体中含有极微量的有毒有害物质就会引起很强的反应;除以死亡为指标外,对其生活习性的影响更为灵敏;实验结果判断明确并易于掌握等。在毒理学研究中鱼类有着独特的用途,是急性毒性试验、蓄积毒性试验、亚慢性和慢性毒性试验、致突变、致畸、致癌试验的首选实验动物。1实验动物及加强对斑马鱼的应用鱼类对有毒有害物质十分敏感,因此试验必须选择合格和具有代表性的鱼类。经济合作与发展组织(OECD)、国际标准化组织(ISO)、美国环境保护署(USEPA)等组织机构推荐的实验鱼有斑马鱼、黑头软口鲦(Pimephalespromelas)、日本青鳉(Oryziaslatipes)、孔雀鱼(Poeciliareticulata)等小型鱼类,应用于毒理学研究。随着实验动物科学的发展,有关鱼类实验动物的研究日渐活跃。毒性试验选择的实验鱼除了要求容易获得、实验室易饲养且对毒物较为敏感外,更趋向于性成熟时间和世代周期较短、饲养成本低的小型鱼类。近年来,我国对稀有鮈鲫、剑尾鱼、红鲫等实验鱼进行了纯系培育,并在毒理学、药理学及环境监测方面开展了深入的研究和应用。在毒性监测方面,斑马鱼的应用也越来越广。试验用鱼应选择行动活跃,体色光泽,鱼鳍完整舒展,逆水性强、食欲好,规格整齐(全长5cm左右),无任何病症的健康个体。同一批试验用鱼应在同一条件下获得,试验前暂养一周以上,此间每日投饲1次,进入试验前48h停止投饲,试验中使用的饵料生物必须符合试验要求并严格控制。试验前4d内,暂养鱼的死亡率及发病率必须在10%以下。试验容器的盛水量以2～3L/尾为宜,同一剂量组的每个试验浓度,实验鱼的数量不得少于10尾,水温保持在一定的范围,温水性鱼类为(20～28)±2℃,冷水性鱼类(12～18)±4℃,pH值6.7～8.5,水体溶氧量>4mg/L。试验必须设置仅以水饲养的对照组。若对照组中10%以上的鱼死亡时,该次试验结果无效。平行试验组必须在同一类容器内进行。2急性阈剂量试验急性毒性试验(acutetoxicitytest)是对实验鱼一次或24h内多次染毒的试验,探明环境污染物与机体短时间接触后所引起的损害作用,找出污染物的作用途径、剂量与效应的关系。主要是测定半致死量(medianlethaldose,LD50)、急性阈剂量(浓度)[acutethresholddose(concentration)],观察急性中毒表现、经皮肤吸收能力,以及对皮肤、粘膜、鳃和眼有无局部刺激作用等,以提供受试毒物的急性毒性资料,确定毒副作用方式和中毒反应,为亚慢性和慢性毒性试验的观察指标及剂量分组提供参考。鱼类LD50以周围水环境中存在的有害物质的浓度表示,即在特定时间内,相当于50%死亡率的浓度称为半数致死浓度(medianlethalconcentration,LD50)。通常计算24、48、96h实验鱼类的LD50,根据试验需要,也可将测定的时间缩短或延长。急性阈剂量是一次染毒后引起机体最低程度损害的最小剂量(浓度),是评价毒物非致死性损害的参数,取决于观察指标是否适当以及灵敏度如何。试验药剂原则上使用原剂,对于与水亲和性差的原剂,可加入少量的溶剂使之成为悬浊液,使用溶剂时必须设置只加溶剂的对照组。根据预试验结果确定100%致死浓度和不引起死亡的最大浓度,以此范围按1∶(0.65～0.90)的等比级数确定5～7个浓度组和对照组进行观察。试验开始8h内须经常观察,以后24、48、72、96h定期观察实验鱼的状态,看是否因受药剂影响而橫卧或出现异常状态,同时记录存活鱼尾数。判断实验鱼是否死亡,可用玻璃棒轻触鱼的尾柄部,如鱼不动,即判定死亡。对照组中死亡鱼超过10%或出现不健康鱼时,试验结果无效。依据试验结果使用半对数作图法,求出LD50值,以对数刻度为实验药剂浓度,普通刻度为存活率,在存活率50%的线上,取最接近50%的点(25%～75%),这两点的连接和50%线的交点浓度即为LD50。3蓄积毒性作用蓄积毒性试验(cumulativetoxicityaction)是指以低于中毒阈剂量的污染物反复多次与实验鱼持续接触一定时间后使鱼体出现明显中毒症状的试验。当污染物进入鱼体的速度大于鱼体将其消除的速度,污染物在体内的量不断累积,达到对鱼体产生毒副作用的阈剂量。毒性在体内的蓄积是引起亚慢性毒性作用和慢性毒性作用的基础。因此,蓄积毒性作用常常是评价环境污染物毒性作用的指标之一,也是制订环境卫生标准的重要参考依据。对环境污染物蓄积毒性作用的研究方法有蓄积系数法和生物半减期法等,常用蓄积系数(cumulativecoefficientmethod)K值来评价。根据蓄积系数K值的大小将环境污染物蓄积作用的强度分为4个等级,K<1为高度蓄积;K=1～3为明显蓄积;K=3～5为中度蓄积;K>5为轻度蓄积。4急性毒性试验在接触环境污染物时,通常的接触水平低于急性中毒剂量,急性毒性试验表现出的某些症状很难在短时间内观察到。为了得到更接近实际情况的毒副作用资料,需要进行亚慢性和慢性毒性试验。4.1亚慢性毒性试验亚慢性毒性试验(subchronictoxicitytest)主要研究环境污染物反复多次作用于鱼体引起的损害。通过试验进一步确定环境污染物对实验动物的主要毒副作用、靶器官、最大无作用剂量和中毒阈剂量,为设计慢性毒性试验观察指标及试验设计提供依据。亚慢性毒性试验的实验鱼种属和品系,应为急性毒性试验验证的敏感实验鱼种属和品系,同时还应考虑与慢性毒副作用试验设计使用的实验鱼种属和品系相同。将染毒剂量设计成高剂量组,能引起明显中毒反应,但不引起很多实验动物死亡;而低剂量组则不引起任何中毒反应;中剂量组介于二者之间;同时设对照组。一般以LD50的1/80～1/50为亚慢性试验剂量。主要以综合指标、血液及生化检验、病理组织学检查等对靶器官和最大无作用水平及中毒阈剂量作出初步估计,为进一步开展慢性毒性试验提供依据。4.2慢性毒性试验慢性毒性试验(chronictoxicitytest)是指以底剂量污染物长期与实验鱼接触,观察其对实验鱼产生的生物效应试验。通过慢性毒性试验确定环境污染物对鱼体的最大无作用剂量和中毒阈剂量,为制订环境卫生标准提供依据,对实验动物的致癌性评定亦有一定的参考价值。试验可在鱼类生长、繁殖、孵化和幼体培育等生命活动的各个主要阶段进行。对一些危害大的蓄积性污染物,试验时间不仅要包括一个生命周期,而且要延续三代。染毒剂量一般控制在高剂量组引起明显的毒性反应;低剂量组不引起毒性作用。根据亚慢性试验资料,取其最低中毒剂量的1/10、1/20、1/50(或LD50的1/1000～1/20中的2～3个剂量)设1～2个剂量组作为慢性毒性试验的剂量。在实验室条件下,一般使用流水装置,以保持毒物浓度恒定和实验鱼生活条件良好(如食物、氧气、pH值等)。试验时结合生长、繁殖等生物学指标,测定污染物的积累、分布和释放情况,所得到的存活率、生长率、产卵率和孵化率等数据用统计方法处理。根据试验目的、方法及种类等设定观察项目。外部形态以观察体色、体纹、体表和鳍的变化等为内容;行动以观察对外部刺激的反应、游泳状态及位置、对饵料的反应等为内容;生长指标需测定全长、体长和体重;病理检查则是对实验鱼各脏器组织的病理变化程度进行分级评分(表1)。环境与机体健康的关系是人类关心和探索的一个永恒主题。随着人类对环境污染物认识的不断深入,环境毒理学研究将在多个方向发展。用鱼类作为实验动物来观察环境污染物对机体的毒副作用,试验条件容易控制,试验结果明确,便于分析,是评定环境污染物毒副作用的基本方法。余瑞兰、张彤、卢玲等在不同的研究领域,应用鱼类作为实验动物得到了可靠的试验结果。将鱼类应用于环境毒理学研究已无人质疑,而且还涉及生物学和生物医学等研究领域。在国内,对鱼类学科及