基于fluorsceniniuhybridizaion技术的饮用水细菌学检测方法的研究进展

基于fluorsceniniuhybridizaion技术的饮用水细菌学检测方法的研究进展

大肠菌群是一种需要氧或多氧菌、革兰氏阴性和无芽的细菌。大肠菌群包括:大肠埃希氏菌、产气杆菌和副大肠杆菌。大肠菌群被广泛作为饮用水的细菌学检验指标。传统的检测和计数方法有多管发酵法(multiple-tubefermentation,MTF)和滤膜法(membranefilter,MF)。然而,这些方法都存在一定的缺点,如培养时间长、拮抗微生物的干扰、专一性差等。因此,研究快速、灵敏和专一的大肠菌群检测方法十分必要。这些新技术包括:酶分析法、免疫法、PCR法以及FISH法等。核酸杂交技术是利用寡核苷酸探针来检测互补的核酸序列。探针可以针对DNA,也可以针对RNA。根据细菌的种属和细胞的生理状态不同,细胞内核糖体的数目会发生变化,并且核糖体与细胞的生长速率直接相关。利用对rRNA(主要是16S和23SrRNA)序列专一的探针进行杂交已经成为微生物鉴定的标准方法。目前已对2500多种细菌的16SrRNA进行了测序,在系统发育水平上得到了大量的有用信息。本文介绍了核酸杂交技术的基本原理、在饮用水细菌卫生学检测中的应用、主要优点、局限性以及应用前景。1核酸分子杂交检测核酸杂交以碱基配对原理为基础,利用寡核苷酸探针与靶细胞专一性结合进行生物分析。核酸杂交的基本实验步骤为:细胞固定、杂交(其专一性和严格性依赖于杂交温度和时间、盐浓度、探针长度及其浓度)、洗脱(去除与靶细胞没有结合的和非专一性结合的物质)以及检测。根据碱基互补配对的原则,可以利用核酸分子杂交技术直接探测溶液中、细胞组织内或固定在膜上的同源核酸序列。核酸分子杂交的高度特异性以及检测方法的高度灵敏性,使核酸杂交技术广泛应用于环境微生物的检测,并对它们的存在、分布、丰度和适应性等进行定性和定量分析。2通过测定肠道感染的序列链技术2.1fish技术探针是能够与特定核苷酸序列发生特异性结合的、己知碱基序列的核酸片段。它可以是长探针(10~1000bp),也可以是短核苷酸片段(10~50bp),可以是从RNA制备的cDNA探针,也可以是PCR扩增产物或人工合成的寡核苷酸探针。探针既可以用放射性核苷酸标记,也可以用非放射性分子标记。核酸杂交试验并不要求探针与靶核酸序列之间百分之百地互补。有限数目的非互补碱基对的存在是可以接受的。一些寡核苷酸探针可以从市场上买到。为了保证杂交反应较高的专一性,探针长度一般为15~30个碱基。早期的原位杂交(insituhybridization,ISH)利用放射性标记探针进行杂交物的检测。目前关于rRNA的原位杂交研究几乎都是利用荧光标记的核苷酸探针进行检测。FISH技术近年来得到广泛应用,这是因为,与放射性标记相比,荧光标记具有以下特点:反应灵敏;杂交细胞可以直接在荧光显微镜下观察;杂交产物稳定、安全;检测时间短;可以进行多重标记;操作简便等。荧光素和罗丹明染料是最常用的荧光色素标记物,最近,CY3染料也引起了人们的注意。2.2e.coli和e.fe规则探针的检测大肠埃希氏菌,又称大肠杆菌,一般不致病。但当它们转移至非正常的定居部位时也可以致病,如引起肾炎、膀胱炎和泌尿道感染等。某些菌株能产生肠毒素(enterotoxin),引起婴儿和幼畜严重腹泻。大肠杆菌常作为饮用水卫生学标准的指示菌,也是微生物学基础研究的重要材料。对于检测E.coli的rRNA的探针序列可以从一些文献中查到。例如,EC1531探针,与23SrRNA序列互补,由20个核苷酸组成,C+G含量为55%。Shi等利用该探针检测E.coli,对杂交条件进行了研究,但没有给出试验结果。他们在实验室微环境中提取的核酸样品中加入E.coli的DNA,该探针仅用于控制实验。Regnault等利用Colinsitu探针检测了尿、水(河水和生活污水)以及食品中的E.coli和E.fergusonii。该探针与16SrRNA序列互补,由24个核苷酸组成,其C+G含量为46%。该探针对所研究的不同环境介质中的E.coli具有很好的专一性,已经成功地应用于饮用水样品中E.coli的检测(表1)。2.3肠杆菌科和ent1探针对于总大肠菌群这一组微生物,不可能设计出专一性的16SrRNA探针。这是因为,水的卫生学检验上定义的大肠菌群包含了在分类学上属于不同属的一组细菌。因此,开发的探针主要是针对于肠杆菌科(Enterobacteriaceae),而不是总大肠菌群。肠杆菌科是由一大群形态相似的革兰氏阴性小杆菌组成,包括埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)。这些微生物兼性厌氧,能够发酵糖类产酸,通常不产气,周生鞭毛,可以运动。这些细菌通常栖居在人和动物的肠道,也存在于土壤和水域中。沙门氏菌和志贺氏菌是食物和水传播的肠道病原菌。Mittelman等开发了ENTERO探针,并用于临床检验尿道感染。Loge等利用ENT1探针进行了废水样品的分析。这两种探针的组成和杂交条件均不相同。ENTERO探针长度为25个碱基,C+G含量为48%,而ENT1探针长度为17个碱基,C+G含量为70%。Maidak等的研究结果表明,对于检测Enterobacteriaceae,ENT1探针比ENTERO探针具有更高的专一性。3荧光定量测定杂交细胞通常用落射荧光显微镜检测,利用DAPI等进行负染色后可以测定细胞总数。利用流式细胞仪(flowcytometry)可以对于每一个靶细胞-探针杂交物的荧光强度进行定量测定。饮用水中的大肠菌群的数目一般很少,因此利用FISH方法进行检测时需要精心选择分析仪器。Joux和Lebarob比较了不同的荧光检测仪器(如,落射荧光显微镜、流式细胞仪、共焦扫描激光显微镜和新的固相激光扫描细胞仪等)对杂交荧光信号进行定量和定性分析的局限性。结果认为,固相激光扫描细胞仪可以在直径为25mm的膜上直接检测杂交细胞,可望用于饮用水中低浓度细菌的直接计数检测。4pan探针和监管场杂交FISH技术似乎是细胞水平上的一种高度专一性检测方法。然而,由于饮用水中营养物浓度非常低,细菌处于饥饿状态。因此,FISH技术用于饮用水的细菌卫生学检测时存在一些限制因素。这些因素大多与细菌染色体含量较低有关。在营养饥饿状态下,细菌的染色体含量降低,因而细胞中的16SrRNA减少,导致荧光杂交信号减弱。这也许是我们很少在文献中看到FISH方法用于饮用水中微生物研究的原因。为了增强饥饿细胞的杂交信号,人们研究了一些荧光增强方法,例如,多重探测(在传统的FISH技术中,采用的是单标记探针探测),生物素-亲合素标记等方法均可用于增强由于饥饿细胞导致的弱杂交信号。Prescott和Fricker报道了利用肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)作为探针进行原位杂交,检测自来水中的E.coli。杂交结果与利用传统的平板计数法得到的结果一致。PNA是一种合成的核酸,用肽骨架取代了核酸中的戊糖-磷酸骨架,是一种新型的DNA模拟物,具有与DNA和RNA结合的高度亲合性和良好的稳定性。利用PNA代替DNA作为探针的优点主要有:可以更好的抵御核酸酶的进攻,杂交与盐浓度无关,专一性更高,探针序列可以更短,杂交的灵敏度更高等。由于PAN探针与靶位置的结合更强,杂交反应可以在较短的时间完成(30min)。目前,PAN探针除用于E.coli的检测外,还没有用于饮用水中大肠菌群或病原菌的检测。在该探针用于大肠菌群杂交计数前,需要针对不同的分析样品进行探针的选择和杂交条件的优化。利用FISH技术检测饮用水的微生物污染时,另一个主要问题是细胞的存活力。细胞中rRNA的含量与细胞的生长速率直接相关。然而,微生物细胞内rRNA的含量并不能完全反映出其生理状态。即使细胞失去培养能力后,细胞内少量的rRNA分子还可以保留相当长一段时间。例如,S.aureus和E.coli经过热灭活或紫外线辐照后,48h后还可以检测出细胞内的rRNA。Sheridan发现,E.coli在100、80和60℃下经过热灭活,16h后仍然可以检测出细胞中的16SrRNA。Prescott和Fricker将E.coli菌株用1.5mg/L的氯气处理30min,然后利用PAN探针和荧光增强系统进行检测。结果表明,E.coli经过加氯处理后立刻进行杂交,仍然可以被检测出,而利用传统的平板计数法或Colilert法却检测不出。加氯处理2周后,利用PNA探针-TSA试剂盒仍然可以检测出10%的E.coli细胞。该方法的优点是不可培养的大肠菌群也可以被检测出,其缺点是死细胞也可能被计数。因此,利用FISH方法对细菌计数后,尚需对细菌的生理状态进行进一步研究。解决这个问题的途径之一是将FISH检测与直接活菌计数(directviablecount,DVC)方法结合起来。利用FISH方法检测饮用水中的E.coli,得到的检测结果远高于传统的平板计数法的结果。5作为饮用水中大肠菌群的检测指标和方法利用FISH方法进行饮用水的卫生学检测,其专一性强,操作简单。该方法的专一性取决于寡核苷酸探针的专一性和杂交反应条件的严格性。但是,探针序列的确定仍然是费时费力的工作,并且,FISH方法不能用于在系统发育上不确定的微生物,例如大肠菌群。在这种情况下,可以考虑利用在系统发育上与之关系最密切的、系统发育上确定的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)作为代替指标,指示水体被粪便污染的情况。FISH技术可以作为饮用水中大肠菌群检测和计数的替代方法,它可以在1天内给出定量检测的结果。目前,寡核苷