果树遗传育种的研究进展

果树遗传育种的研究进展

通过各种生物育种计划，许多生物的海沟被测试序列，测序费用可以降低。因此，一个单独的海沟至少需要数千美元。截止2009年,人类已经完成了人、牛、猪、拟南芥、葡萄、杨树、番木瓜、水稻、高粱等物种的基因组测序任务。随着这些基因组计划的完成,各种组学开始发展和完善起来,并突破了原有的学科界限形成多门交叉学科。经典的分子生物学研究是一种垂直型的研究,即采用多种手段研究个别的基因和蛋白质功能。而基因组学、蛋白质组学和其他各种组学则是水平型研究,即以单一的手段同时研究成千上万个基因或蛋白质的功能及它们的关系。而新兴的系统生物学则把水平型研究和垂直型研究及传统的生物学整合起来,成为一种三维的研究。各项基因组计划的完成以及相关组学技术的发展,标志着生物学研究进入了后基因组和系统生物学时代。当前基因组测序技术以及各种组学的迅速发展也为果树研究领域提供了前所未有的机遇。2007年,两个研究小组公布了欧亚种葡萄(Vitisvinifera)的基因组框架图,美国的一个研究团队2008年完成了番木瓜的基因组测序。除了葡萄和番木瓜外,其他果树(如苹果、梨,柑橘等)的全基因组测序正在进行之中或即将完成。这些果树全基因组测序的完成或即将完成预示着果树学研究进入了一个新时代,即后基因组学和系统生物学时代。基因组测序是果树功能基因组研究的基础。研究者可以根据基因序列,利用分子生物学及生物工程技术手段研究基因的功能。更为重要的是,研究者可以在系统水平上来研究果树基因组、转录组、蛋白质组、代谢组、以及表型组之间的关系。不仅从理论上可以阐明生物系统的机理,而且可更有效的将优良的基因通过遗传转化的方法导入栽培品种,培育优良新品种,这对于提升果树育种水平和培育新品种具有重大意义。我们系统地介绍并综述了葡萄基因组和后基因组学、比较基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、表型组学等方面的研究进展,以及它们之间的关系。提出了葡萄生物学进入后基因组学和系统生物学时代后所面临的挑战及其相应的解决方案,并对中国葡萄后基因组学及系统生物学研究提出了建议。这也为其他果树作物后基因组学和系统生物学的研究提供了参考。1系统生物学的含义以往的分子生物学只是对个别的基因和蛋白质进行研究,而基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学以及表型组学则是对群体的研究。这些组学的关系见图1。随着计算机技术的成熟和应用,人类已经悄然的跨入系统生物学时代。所谓系统生物学(SystemsBiology),是指研究一个生物系统中所有组成成分,包括基因、mRNA、蛋白质等,以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科。显然,系统生物学使多方面的生物信息整合成为一个网络。系统生物学的研究过程是先取得一个生物、组织或细胞系统,分析各种内部因素,获得DNA、RNA及蛋白质相互作用的信息,整合各类信息后,开发出能描述系统结构和行为的模型,最后可以根据这个模型,预测生物系统的行为。因此,系统生物学是结合许多不同学科领域,通过彼此相互的网状合作,针对一个生物现象所进行的研究。2拟南抗氧酸盐植物的进化树特征随着人类基因组测序项目的顺利完成,科学家们同时开展了多种生物的基因组测序项目。在人类基因组草图公布后的10a间,拟南芥、水稻、杨树、葡萄、番木瓜、高粱等植物的测序工作相继或接近完成,或正在进行中。其中双子叶植物包括拟南芥、番木瓜、苜蓿、大豆、杨树和葡萄,单子叶植物包括玉米、高粱和水稻。这些植物的进化树如图2。双子叶植物中拟南芥和番木瓜的亲缘关系较近,苜蓿与大豆聚为一类,葡萄是已测序的类真蔷薇植物中分化最早的植物。另外在单子叶植物中,玉米与高梁聚为一类。3化对于化中的作用葡萄是多年生藤本植物,浆果为非呼吸跃变型,大多数葡萄种的染色体数为2n=2x=38,但V.rotuniflolia的染色体数为2n=2x=40。葡萄是继拟南芥、杨树、水稻之后,基因组测序完成的第4种显花植物,也是第1种被测序的果树类双子叶植物。Soltis等利用多种方法,对被子植物的起源和早期进化进行分析,葡萄大约在8400万年前已经分化出来了,在物种的进化中起着非常重要的作用。葡萄基因组的测定为显花植物中双子叶植物的I类真蔷薇和II类真蔷薇植物出现分化这一重要进化过程提供了基因资料,使我们有可能发现它们共同的古老遗传构成特点和物种起源与进化关系(图2)。法国和意大利的科学家以酿酒品种黑比诺(PinotNoir)的多代自交型(PN40024)为测序对象,于2007年8月完成了欧亚种葡萄基因组序列框架图。黑比诺自交系PN40024由法国国家农业研究院(INRA)下属的Colmar研究中心培育,杂合率为3%~13%。Jaillon等对葡萄测序的基因组进行分析后发现,葡萄的大部分基因都具有原来大小3倍的明显特点和标记,认为葡萄在进化的早期已成为六倍体而保留至今,葡萄基因组未出现基因组加倍。因此认为现在的是古老六倍体(图3),这一点和已证明的杨树、拟南芥和水稻发生过整个基因组加倍是不一致的。Velasco等所测序的材料为PinotNoir的一个高度杂合型(ENTAV115单系),但他们的分析却认为葡萄和杨树、拟南芥一样,基因组都曾在单、双子叶植物分开后出现整个基因组加倍;拟南芥和杨树经历了2次基因组加倍,而水稻经历过1次。2个研究的差别见图3(左图原图中葡萄的进化位置不准确,葡萄的进化位置应在类真蔷薇的基部)。3.1有关葡萄体组成的信息3.2转录因子及测序葡萄基因组中含有2004个转录因子,占基因组的6.7%。在葡萄基因组中发现62个转录因子家族,这些家族如MYB,AP2/EREBP,bHLH和MADS-box等含有很多成员。其中,葡萄的1617个转录因子分布于19个遗传连锁群中。连锁群7和18的转录因子含量高于其他连锁群。AP2/EREBP基因家族存在于连锁群2、7、10和16,CCAAT基因存在于连锁群6、8、10和13;MADS-box基因家族存在连锁群5和13;MYB基因家族存在于连锁群8和17。在葡萄基因组中,MYB基因家族是非常庞大的,MYB基因家族控制葡萄果实次级代谢产物的积累,该基因家族的成员调控花色苷和黄酮醇的合成。MADS-box基因家族调节开花相关现象,该基因家族在植物的进化中是非常重要的。在葡萄基因组中还有许多与抗病相关的转录因子,如亮氨酸拉链和bZIP类结合蛋白等。3.3结构分类及亚组的分类根据基因对基因假说,植物的抗病性是由植物的抗病基因和病原菌的无毒基因互作决定的。植物的抗病基因及R蛋白有一些共同的结构域,富亮氨酸重复序列(leucine-richrepeat,LRR)、核苷酸结合域(nucleotidebindingsite,NBS)、果蝇Toll蛋白和动物白介素-Ⅰ受体同源结构域(tollandinterlukin-1receptorhomologyregion,TIR)、丝/苏氨酸激酶结构域(serine/threonineproteinkinase,PK)、跨膜结构域(transmembrane,TM)、卷曲螺旋域(coiled-coil,CC)、亮氨酸拉链(leucinezipper,LZ或ZIP)结构域等。根据N’-末端结构的差异,该组又可分为2个亚组,即TIR-NBS-LRR(I)亚组和CC-NBS-LRR(II)亚组,LZ只是CC的一种特殊结构。Velasco等对葡萄基因组中的抗病基因进行了系统的分析,葡萄基因组中含有341个NBS类基因,其中233个NBS类基因包括LRR结构域,CC-NBS-LRR类基因有84个,TIR-NBS-LRR类基因有37个。NBS类基因家族含有5个TIR-NBS类基因,112个NBS-LRR类基因,103个仅含有NBS类结构域基因。除NBS类R抗病基因外,葡萄基因组中还含有许多抗病信号转导基因,如NPR1、EDS1、PAD4、COI1、MPK4、JAR1、ETR1、NDR1、RAR和EIN2等,NPR1、RAR和EIN2都是单拷贝。另外,葡萄基因组中含有许多病程相关蛋白,9个拷贝的PR-1,8个拷贝的PR-2,5个拷贝的PR-3,多拷贝的PR5,1个拷贝的PDF1和PDF2,以及一些蛋白抑制基因。葡萄基因组中还含有8个类似MLO基因。白粉病抗性基因PEN1,PEN2和PEN3,分别在葡萄基因组中含有5个、5个和10个拷贝。这些抗病基因分布在葡萄的19条染色体上,TIR-NBS-LRR类抗病基因分布在第18号染色体上,CC-NBS-LRR类基因分布在第9和13号染色体上,单一NBS类特征的抗病基因分布在第12和13号染色体上。抗病基因在染色体上的分布呈丛或簇的形式。4后基因组研究葡萄基因组全序列蕴含了大量的信息,包括基因的序列和结构、非编码区的特征、基因的拷贝数、基因的相对位置、染色体的结构等。研究者可从表现型研究转入基因型研究,从对单一基因的研究转入对整个基因组研究,进而可以研究基因之间的相互关系及其网络结构。后基因组的研究主要包括以下几个部分:1)比较基因组研究,包括种内的基因组比较和种间的基因组比较;2)转录组学、蛋白组学、代谢组学、表型组学以及DNA与蛋白、蛋白与蛋白之间的相互作用关系研究;3)基因和基因家族的系统特征研究,包括生长与发育、果实的质量与产量、抗病虫、抗胁迫和对环境的适应情况、葡萄酒的质量与特性以及与人类健康相关的特性等。4.1物种结构的基因组化比较基因组学(comparativegenomics)是在基因组图谱和测序的基础上,进行基因组之间的比较研究以获得生物类群中的基因数目、位置、功能、表达机制和物种进化的学科。基因组比较分为种间比较和种内比较。随着葡萄基因组序列测序完成,科研工作者通过比较基因组学对葡萄基因家族进行分析。利用葡萄的基因组或者是基因家族,通过种内基因组或种间的基因组序列比较,可以得到我们感兴趣的基因,然后利用基因工程的技术,通过转基因将优良的基因转入葡萄和其他植物,培育具有优良性状的品种。4.1.1水稻和水稻中的亚家族成员MYB基因家族是植物中最主要的转录因子之一。目前,在葡萄基因组中已经发现有279个MYB基因成员,而在拟南芥和水稻中分别为198、183个。这些成员包括R1R2R3、R2R3、MYB和MYB相关的亚家族成员。水稻和拟南芥的R2R3亚家族成员分别为126和109个,葡萄中有108个。除第10号染色体外,葡萄的MYB基因分布在其他每条染色体上,其中在第2、4和14号染色体上含有的MYB基因家族成员较多。4.1.2葡萄偏转座子序列及基因家族的构建Tvv1、Vine1和Ty3/gypsy-likeGret1等3类逆转录转座子已经被广泛研究。基因组测序后,Moisy等在葡萄基因组中发现27个逆转座子序列,并且将其中的24个新的逆转座子序列通过氨基酸BLAST比对,建立系统进化树,分成10个新的基因家族,分别为:Gentil、Edel、Huben、Rangen、Bran、Cremant、Gan、Kaste、Noble和Wintz。到目前为止,葡萄逆转座子有13个家族,1709个拷贝,占基因组序列的1.24%。其中13个家族中,最少的拷贝数为91个,最多的达到212个。4.1.3葡萄中mads-box基因FT/TFL1基因可以促进或抑制开花基因的表达,Carmona等通过RACE技术从葡萄mRNA中克隆了5个同源基因,分别命名为VvFT、VvMFT、VvT-FL1A、VvTFL1B、和VvTFL1C。并且进行了基因组DNA的扩增,该5个基因都含有4个外显子和3个内含子。这5个基因分别属于FT、MFT和TFL13个亚家族。MADS-box基因家族在多种植物的发育过程特别是花器官和果实发育过程中发挥重要的作用。在植物、动物和真菌中发现的MADS-box基因分为TypeⅠ和TypeⅡ两种类型。在植物中,TypeⅠMADS-box基因的功能仍不清楚,所有已知功能的基因都属TypeⅡ基因。其中TypeⅠ基因只含有MADS-box保守区。TypeⅡ基因由保守程度不一的MADS-box、I、K和C结构域(domain)组成,所以又叫MIKC-typeMADS-box基因。在葡萄基因组中含有38个MIKC-type基因,分别属于13类亚基因家族。这些基因至少分布于13条染色体上,其中18号染色体含有6个,1号染色体含有5个,14和17号染色体上分别含有3个,10和15号染色体上含有2个,2、4、7、8、12、13和16号染色体上分别含有一个基因。AP1/FUL,SEP和FLC亚家族中的成员分布于第1、14和17号染色体上;SOC1亚家族成员分布于第2、15和16号染色体上;AGL15亚家族成员分布于第8和13号染色体上;AP3/PI和SVP亚家族分布于第4、7和18号染色体上;AG亚家族中的2个成员分布于第10和12号染色体,第3个成员分布在第18号染色体上。4.1.4ap2/erf家族在葡萄中的转录和分布AP2/ERF是植物所特有的一类转录因子,每个成员都含有由保守的乙烯应答结合元件(ethylene-responsive-element-binding),即AP2/EREBP结合域。AP2/ERF家族在植物中广泛存在,参与植物的抗病、抗逆、激素响应(乙烯)等生理生化反应的信号转导以及花器官形成等。在葡萄中,通过全基因组搜索已发现132个AP2/ERF家族成员,分为4个亚家族(AP2、DREB、ERF、RAV和其他)。这些基因分布在19条染色体上,其中第7号染色体上有19个,第16号染色体上有22个,而第3、12、19上各有1个AP2/ERF类基因。通过和拟南芥中的AP2/ERF转录因子比较后发现,葡萄中ERF亚家族分布在拟南芥AP2/ERF的B1、B2、B3、B4、B5和B6组中,DREB亚家族则分布在A1、A2、A4、A5和A6组中。在第6和18号染色体上各存在一个10kb左右串联分布的区段,而在第16号染色体415kb的区段内分布了20个AP2/ERF基因。4.1.5水孔通道蛋白基因表达水孔蛋白是膜水通道蛋白,在控制细胞和组织中水的含量起着非常重要的作用。葡萄基因组有28个水孔通道蛋白基因,分为4个亚家族,分别为质膜水孔蛋白(theplasmamembraneintrinsicproteins,PIPs)、液泡膜水孔蛋白(thetonoplastintrinsicproteins,TIPs)、与大豆根瘤菌周膜上水通道蛋白NOD26类似的通道蛋白(thenodulin26-likeintrinsicproteins,MIPs)及小分子量的膜内在蛋白(thesmallandbasicintrinsicproteins,SIPs)。在葡萄浆果成熟的过程中,水孔通道蛋白基因的表达水平下降。中性转化酶(Neutralinvertases,NIs)可以将蔗糖转化为葡萄糖和果糖。葡萄基因组中含有9个中性转化酶基因成员,其中8个成员分别位于葡萄的第3、5、6、13、14和18染色体上,第9个成员位于scaVold_203。通过氨基酸序列比对、内含子和外显子结构以及染色体定位等多重结合分析,4个属于α类Nis,5个属于β类Nis。4.2葡萄成熟过程中相关基因的表达转录组是指生物在特定的时间和空间条件下,所表达的所有基因的总和。通过对转录组学的研究,可以找到植物在特定的时期起关键作用的基因,分析基因之间的相互关系,研究基因网络结构。从而找到对生产和育种有用的基因,进行更加深入系统的研究。葡萄是非呼吸跃变型果实,有2个迅速生长期。果实成熟包括各种不同的生物学过程,如细胞分裂与扩大、初级与次生代谢以及各种生物与非生物胁迫等。在葡萄果实成熟的过程中,花色苷、有机酸和糖大量积累,同时对病原菌也相对敏感。daSilva等根据拟南芥的同源蛋白基因和葡萄相关方面的研究,将葡萄开花到浆果成熟过程中87个不同表达基因分成8个功能组,分别为:1)病程相关蛋白(几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、脂氧合酶、非特异性脂转移蛋白、防御素等);2)非生物胁迫、细胞氧化还原平衡以及转运蛋白(热激蛋白、金属硫蛋白、硫氧还蛋白、植物氧化还原酶家族和多酚氧化酶等);3)初级代谢(包括CO2同化作用、糖代谢、脂类代谢、氨基酸的生物合成);4)次生代谢;5)浆果的生长、膨胀和水分关系;6)乙烯代谢;7)过敏多肽和种子特异蛋白;8)其他有益蛋白质。Grimplet等对葡萄成熟果实3个组织(表皮、果肉和种子)的mRNA表达进行了系统的研究,在转录水平上,弄清了葡萄果实组织特异基因表达的网络结构。通过葡萄微阵列分析,大约76%的基因在葡萄浆果组织表达,在mRNA水平上,其中约60%的基因表达具有显著性差异,另外大于28%的基因具有极显著差异。种子和果皮/果肉的mRNA表达差异最大。外果皮中,病原菌防御基因和色素相关基因的表达量高于果实其他组织的类黄酮生物合成、抗病和细胞膜修复基因。中果皮(主要的营养部分)中细胞膜功能和转运作用的基因的表达量较高,种子(胚胎发育的主要资源)苯丙素生物合成酶、种子贮藏蛋白和胚胎晚期富集蛋白的表达量较高。Pilati等通过对葡萄果实成熟过程中不同时期的基因表达分析,认为葡萄果实成熟有2个显著的阶段:转熟期前表现细胞代谢过程,涉及激素信号和转录调控等大量基因的表达;转熟期后为成熟果实表型特征相关的成熟特异代谢基因的表达。转熟期阶段发现了氧化爆发和抗氧化酶网络的调节机制。4.3葡萄成熟过程中糖代谢、能量、蛋白合成与压力的变化随着后基因组时代的到来,功能基因组研究成为研究的重点,而蛋白质组学研究是功能基因组一个重要的组成部分。Giribaldi等对葡萄从开花到果实完全成熟过程通过双向凝胶电泳分离了大约730个蛋白点,通过液体芯片蛋白指纹飞行质谱系统(MALDI-TOF)分析,有118个蛋白点有差异表达。这些蛋白质大多数与代谢、能量、蛋白合成与分解有关,较少与响应胁迫有关。并且认为在葡萄果实成熟过程中糖酵解普遍降低,病程相关蛋白增加,氧化胁迫降低,而大规模的细胞骨架重排。在果实成熟过程中,Zhang等分析葡萄果实成熟过程中质膜蛋白的差异表达,利用双向凝胶电泳分离出了119个蛋白点,其中62个被认为是质膜蛋白,包括ATP合成酶、ABC转运体和GTP结合蛋白等,分为8个功能组,分别为转运、代谢、信号转导、蛋白合成、能量、转录、细胞生物源以及一些未知蛋白。在果实成熟过程中,质膜蛋白含量逐渐降低。从葡萄转熟期前到转熟期后,泛素蛋白水解酶和细胞骨架蛋白增加。在葡萄转熟期,玉米素O-葡萄糖基转移酶表达量最高,泛蛋白连接酶E2-21下调。Vincent等研究了干旱和盐胁迫对两种酿酒葡萄Chardonnay和CabernetSauvignon的影响,发现品种Chardonnay较耐干旱和盐胁迫。在品种CabernetSauvignon中,代谢相关蛋白含量有所增加,而在Chardonnay中,上调的蛋白质功能未知。4.4其他基因型的关系所谓代谢组学是指某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的一门新学科,是功能基因组学研究的重要组成部分。代谢组的各种成分,即代谢产物是基因表达的终产物。代谢组是一个细胞或组织的生物化学表现型,可以全面了解该生物或细胞的生物化学状态,获得众多信息。代谢组学将基因产物和基因联系起来,揭示基因和表现型之间的关系,可以达到研究基因功能的目的。葡萄次生代谢产物尤其是多酚对葡萄酒的质量有很大的影响,而绝大多数的酚类物质是通过苯丙氨酸解氨酶途径合成的。在红色葡萄中,黄烷醇和花色苷的含量很多,花色苷主要积累在果皮中,而黄烷醇主要积累在种子中。葡萄基因组序列测序完成将会有助于弄清苯丙烷类代谢途径。关于苯丙氨酸代谢途径中的编码相关酶的基因已经发现,这些基因大多数属于大的基因家族如(PAL,F3’5’H)和较小的基因家族(如CHS,F3H,FLS,LAR),剩余的基因都是单拷贝基因,如C4H,4CL,CHI,F3’H,DFR,LDOX,ANR,UFGT)。萜类化合物是植物生长和发育过程中是必需的,在植物与外界环境之间的相互作用中起着非常重要的作用。异戊烯基焦磷酸IPP及其异构体二甲丙烯焦磷酸DMPP是大约22000类萜类化合物的前身。IPP在细胞质,DMAPP在质体中通过甲羟戊酸(MVA)以及(MVA)依赖DOXP/MEP途径合成的。DMAPP、GPP、FPP或GGPP分别是单萜、倍半萜类和二萜的前身。4.5基于人为诱导的突变研究前面所阐述的是从“中心法则”“自上而下”地从基因序列—表现型来研究基因的功能并开发和利用,而表型组学则是“自下而上”地从表现型—基因序列来研究基因的功能并开发和利用(图1)。这种研究方法也被认为是反向遗传研究法。从葡萄的芽变入手研究其变异的机理是典型的反向遗传研究法。人为的收集所有芽变或用不同方法