生物化学教学课件：第21章 基因重组和基因工程

基因重组和基因工程

GeneticRecombinationandGeneticEngineering第二十一章第一节

自然界DNA重组和基因转移是经常发生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequently

inNatureDNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用

(transduction)转座

(transposition)同源重组

(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组是最基本的DNA重组方式Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链结合，形成分支侵扰；通过分支移动产生异源双链DNA，并连接成Holliday中间体；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体（见模型图右边产物）：

切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图左边产物）：

切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。

内切酶

(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移

(recA)

内切酶(recBCD)

DNA

连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶拼接重组体片段重组体二、细菌的基因转移与重组有四种方式■接合作用■转化作用■转导作用■细菌的特异位点重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。可接合质粒如F因子(Ffactor)细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。质粒（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用

(transformation)。例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)

溶菌

溶源目录（四）细菌的特异位点重组沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合位点特异重组(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌体DNA的整合（二）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(

和

)，一个编码重链。

轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLV

D

JC重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程基因片段两端RSS互相靠拢，

它们间DNA环被剪除，选定的基因片段连接四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。

插入序列(insertionsequences,IS)组成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列转座二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重复序列一个转座酶（transposase)编码基因插入序列发生转座的形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)插入序列的复制性转座转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座转座子组成：

反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因

细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L由转座子介导的转座第二节

重组DNA技术

又称DNA克隆或分子克隆

DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone一、重组DNA技术相关概念克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆技术水平：分子克隆(molecularclone)

（即DNA克隆）

细胞克隆个体克隆（动物或植物）

应用酶学的方法，在体外将各种来源的DNA——目的基因（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——重组体DNA，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，称基因克隆或DNA克隆

。

DNA克隆

目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆或/和表达所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。（二）工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而无53

外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定义：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。来源：细菌的限制修饰系统分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）TypeI

同时具有修饰及识别切割的作用；另有识别DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位距离识别位可达数千个碱基之远。TypeⅡ

只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列；所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。TypeⅢ

与第一型限制酶类似，同时具有修饰及识别切割的作用。可识别短的不对称序列，切割位与识别序列约距24-26个碱基对。

第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：Hin

dⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶特点：

识别回文结构(palindrome)

切点在识别顺序内

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶

（三）基因载体

定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。后者应有强启动子/弱启动子+增强子载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。质粒

(plasmid)特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。编码β-半乳糖苷酶N-端（α片段）

λ噬菌体DNA改造系统

λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）

EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列粘性质粒(cosmid)λ噬菌体DNA两端的互补单链：包含噬菌体DNA复制的全部信息；是噬菌体包装的必需结构

酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)

细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)

动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他二、重组DNA技术基本操作过程基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

以质粒为载体的DNA

克隆过程（一）目的基因的获取化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库mRNAcDNA

双链cDNA重组DNA分子cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制

从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT（二）克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。（三）外源基因与载体的连接方式：(1)同一限制酶切位点连接

(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接粘性末端连接BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。平端连接

限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。同聚物加尾连接5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

人工接头(linker)连接人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌转化

转化(transformation)

重组质粒DNA导入细菌或酵母菌，称转化。有：氯化钙法、电穿孔法。

转染

(transfection)

重组DNA（强调是裸DNA）导入真核细胞（酵母除外），或者是噬菌体DNA导入细菌，都称为转染。有：磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法、显微注射法、电穿孔法等。

感染

(infection)

以噬菌体或病毒DNA为载体，重组后首先导入包装菌包装成病毒颗粒（不是裸DNA），再以病毒感染的形式导入细胞（真核或细菌）。1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选(插入失活法)

抗药性标记选择α互补利用α互补原理筛选重组体pUC18X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷）被酶解产生蓝色

原位杂交

Southern印迹鸡的β肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法重组DNA技术操作过程可形象归纳为：小结分分离目的基因与载体切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体

转转入受体细胞筛筛选重组体转化子细胞

表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达

标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点

E.coli表达体系的不足：不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)

；很难表达大量可溶性蛋白。1.原核表达体系(E.coli表达体系最为常用)大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌

优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA

可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、不经济

转染

——将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染

DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）第三节

重组DNA技术与医学的关系非常密切并前景远大DNARecombinationTechniqueisCloslyRelatedwithMedicineandhasaGoodPerspective一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。

疾病基因发现的两个典型例子:脆性X综合征Kallmann综合征二、生物制药利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。美国EliLilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。

重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱基因工程药物1、干扰素系列

IFN是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质。分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ3种干扰素。干扰素具有（一）抗病毒作用（二）抗肿瘤作用（三）免疫调节作用。

2、白介素系列

白细胞介素是非常重要的细胞因子家族，现在得到承认的成员已达15个；它们在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它们还参与机体的多种生理及病理反应。

3、集落刺激因子类药物（CSF）

4、其他基因工程药物促红细胞生长素（Epo）、人生长激素（GH