用aflp技术对中国产六木属phy作业种间关系分析

用aflp技术对中国产六木属phy作业种间关系分析

乔木r.布朗是东亚和北美之间的段布局（吴正扬，1991）。一般认为,与六道木属最近缘的属为北极花属(LinnaeaL.)和猬实属(KolkwitziaGraebn.)。六道木属含两个组,六道木组(sect.Abelia)和管花六道木组(sect.ZabeliaRehd.),有的学者认为它们是不同的属(Golubkova,1972;Hara,1983;Ohba,1993;汤彦承和李良千,1994)。六道木组分布于中国、日本和墨西哥。墨西哥产六道木原先认为有2种,近来又增加了3种(Villarreal-Q,1997;Villarreal-Q&Rosa-I,2000),它们属于墨西哥六道木系(ser.VesaleaeZabel)。六道木组日本产3种,形态上十分接近,组成黄花六道木系(ser.SerrataeGraebn.)。黄花六道木(AbeliaserrataSieb.etZucc.)长久以来一直被认为是个日本特有种。虽然过去有的中国标本被鉴定成黄花六道木,但都是误定。Rehder(1911)认为,被鉴定成A.serrata的中国的标本乃A.graebnerianaRehder或A.unifloraR.Brown。然而,根据胡嘉琪(1988)的意见,Rehder提到的A.graebneriana为A.engleriana(Graebn.)Rehd.的异名,而A.uniflora与A.parvifoliaHemsl.形态上十分相似。黄花六道木与这些种均有明显的差别,其中最直观而显著的差别为花冠的颜色。我们最近在浙江省永嘉县采集到六道木属的标本,经鉴定为黄花六道木。中国的六道木属种类丰富,变异复杂,分类鉴定困难很大,而DNA序列的分辨率低(如ITS序列),不能完全揭示种间关系(待发表)。为了从整个基因组水平上揭示六道木属物种的系统关系,我们采用AFLP技术(Vos等,1995),首先对东亚产六道木属六道木组及其近缘类群的代表种进行分析,目的是(1)探讨AFLP在分析种间关系上的适用性;(2)分析六道木属与近缘的猬实属的关系;(3)分析六道木组的种间关系;(4)鉴别浙江省永嘉县采集到六道木属的标本与日本产A.serrata是否为同一物种。1材料和方法1.1锦带花属种抗菌药dna的合成实验材料包括六道木属六道木组(AbeliaR.Br.sectionAbelia)7种11个样品,管花六道木组(AbeliaR.Br.sectionZabeliaRehd.)2代表物种,猬实属1种和锦带花属1种2份样品(表1)。DNA从硅胶干燥的叶片用CTAB法提取(Doyle&Doyle,1987)。DNA提取后,用RNase去除RNA,然后用Promega公司的WizardDNAClean-UpSystem(产品编号A7280)纯化。纯化后DNA的浓度调整为100～150ng/μl。1.2pcr扩增和选择性扩增AFLP分析采用ABI公司的“AFLPPlantMappingKit”试剂盒(AppliedBiosystems,P/N402004,402005,4303050)。酶解与接头连接同步进行,总体积为10μl。反应体系为1×T4连接酶缓冲液(含ATP),50mmol/LNaCl,5ngBSA,5单位的EcoRI,1单位的MseI,1Weiss单位的T4DNA连接酶,0.5μmol/LEcoRI接头,5μmol/LMseI接头,约0.5μgDNA。混合液用1滴矿物油覆盖,在室温下过夜。次日用0.1×TE稀释20倍,存-20℃备用。预选择性扩增(Preselectiveamplification)的反应体系为20μl,含15μl的AFLPAmplificationCoreMix,各125μmol/L预选择性扩增引物,4.0μl稀释后的酶解与连接产物。PCR反应为2′@72℃,30个循环的20″@94℃,30″@65℃,2′@72℃,最后在60℃延伸30min。PCR产物用0.1×TE稀释20倍备用。我们用3种荧光标记的5对引物进行选择性扩增。引物的组合为EcoR-ACA/Mse-CAC、EcoR-ACT/Mse-CTA、EcoR-AAG/Mse-CAG、EcoR-ACC/Mse-CTG和EcoR-ACC/Mse-CAT。其中EcoR-ACA和EcoR-ACT为FAM标记,EcoR-AAG为JOE标记,EcoR-ACC和EcoR-ACC为NED标记。PCR反应体系为10μl,含7.5μl的“AFLPAmplificationCoreMix”,0.5μl的EcoRI引物,0.5μl的MseI引物,1.5μl的稀释的预选择扩增产物。PCR程序为2′@94℃,30″@66℃,头10个循环每个循环退火温度递减1℃,直到56℃,后30个循环维持在56℃,2′@72℃。最后在60℃延伸30min。1.3电泳分离和离子测序选择性扩增产物用BioWhittakerMolecularApplications公司的LongRangerSingelpacks(cat.#50691)在ABI377自动测序仪上电泳分离和记录。由ABI377自动测序仪收集的AFLP电泳数字图象经GeneScan(version3.1)分析,计算出DNA片段的长度并生成样品文件,样品文件经Binthere(Garnhart,2000)汇集后输出DNA片段分子量矩阵,再由MG(Zhou&Qian,2003)计算软件分析产生0/1数据矩阵后,用NTSYS(Rohlf,1993)分析不同引物组合所获得的数据之间的相容性,最后以锦带花属的两份样品为外类群,用PAUP*(Swofford,2001)分析类群之间的系统关系。2点、基地及邻接法分析5对引物共扩增出988个位点,其中EcoR-ACA/Mse-CAC有217个位点、EcoR-ACT/Mse-CTA有184个位点、EcoR-AAG/Mse-CAG有179个位点、EcoR-ACC/Mse-CTG有239个位点、EcoR-ACC/Mse-CAT有169个位点。5对引物的5组数据之间相容性的Mantel检验结果列于表2。两组数据的相关系数为0.725～0.919,其中EcoR-ACA/Mse-CAC与EcoR-AAG/Mse-CAG的关系示如图1。16个样品的988个位点的邻接法分析生成的树的各分支,除个别分支外,都得到很高的支持率(图2)。基部3个分支为:(1)外类群锦带花;(2)管花六道木组两个种和猬实;(3)六道木组的物种。在六道木组这一支,有两个分支,一支为黄花六道木系,另一支为糯米条等其他物种。中国产黄花六道木与日本产的两个黄花六道木样品(Funamoto18和Funamoto20)有比较大的区别,但与另一个样品(Funamoto19)的差别较小。3讨论3.1aflp的应用分子系统学研究存在两类困难。其一是稳定可靠的标记(如DNA序列)差异小、分辨率低,在属内种间,情况常常如此。其二是差异大、分辨率高的分子标记(如RADP等)同源性低,同塑性高。AFLP具有多态性高,重复性好,操作简便等特点,多用于构建物种的遗传图谱、评估遗传多样性、分析品种之间的关系等,也有用AFLP分析种间关系的报道(Aggarwal等,1999;Koopman等,2001;Mace等,1999)。当分子标记不能很好地揭示物种之间的关系时,不同的分子标记或同种标记的不同引物所得到的结果不同,数据组间的相关性低。我们用了5对引物对16个样品进行AFLP分析,获得的5组数据相互之间的相关系数在0.725以上,表明不同组数据均能很好揭示种间关系,从而证明AFLP可用于种间关系分析。3.2教育观研究的结论虽然有胡嘉琪等(1982)、徐炳声(1983)、胡嘉琪(1988)、胡嘉琪和贺超兴(1988)对中国产六道木属的研究,Ohwi&Kitagawa(1992)和Ohba(1993)对日本产六道木属的研究,Lee(1979)对朝鲜(韩国)六道木属的研究,以及Villarreal-Q(1997)和Villarreal-Q&Rosa-I(2000)对墨西哥六道木属的研究,由于这些研究都是区域性,加上六道木属形态变异的复杂性,我们仍难以对六道木属的物种数目和种间关系作出客观的估计。六道木属的两个组分化显著,有的学者视它们为不同的属(Ohba,1993;汤彦承和李良千,1994)。在我们的AFLP分析结果(图2)中,以锦带花属为根,两个分支恰好是六道木属的两个组(猬实除外,见下文)。所以,即使将两个组分别提升为属,它们仍是姊妹群关系。猬实属与六道木属的差别主要是果实类型,前者为两个果实愈合的坚果,后者为分离的坚果。其实,猬实属与六道木属的区别并不大,除了果实外,其他的形态特征都十分相似,这也就是Troll&Weberling(1966)和Weberling(1966)怀疑建立猬实属必要性的原因。我们的研究结果也证明猬实属与六道木属的密切关系。鉴于猬实属独特的果实类型和它与六道木属的密切关系,我们怀疑它由杂交起源,六道木属是其亲本之一。然而,这样的推测仍有待证实。3.3日本产黄花六水品种结构六道木组的7个物种分化为2群。第一群为糯米条、温州六道木、大花六道木、单花六道木和小叶六道木。糯米条和温州六道木虽然形态差异很大,但其遗传分化很小,DNA序列更是一样(待发表)。大花六道木本来是单花六道木与糯米条的杂交种(Rehder,1911),后代在栽培过程中逐渐分离,有的象糯米条,花萼裂片多为5;有的介于两亲本之间,花萼裂片2～5,有的象单花六道木,花萼裂片多为2～3。小叶六道木与单花六道木形态上十分相似,但遗传分化较大,单花六道木应能作为独立的种存在。第二群为日本产的黄花六道木和A.tetrasepala。中国产黄花六道木与日本产黄花六道木在遗传上有一定的差别。日本产3份黄花六道木样品间的Dice(1945)遗传相似性为0.615～0.657,中国产样品与日本产样品之间的遗传相似性在0.548～0.586之间(具体数据没有给出)。日本产黄花六道木存在比较大的形态变异,如花序(Fukuoka,1969)、花冠大小和颜色,毛被的疏密等,从ITS序列的杂合性(待发表)判断,可能存在与近缘种的杂交现象。黄花六道木中国产与日本产样品之间在叶、花序、花和果实等分类上十分重要的形态上尚没有发现明显区别。另外,由于日本产黄花六道木复杂的变异,AFLP数据并没有完全解决两地黄花六道木的关系(如样品Funamoto19和Zhou2002519,图2)。所以,在获得足够的证据之前,将中国产黄花六道木与日本产黄花六道木视为同一物种更为恰当。除糯米条见于琉球群岛外,黄花六道木是六道木属中日本与中国共有的另一种类。黄花六道木在中国的发现又一次证明中日植物区系的密切关系。随着研究的深入,会有更多的证据证明这一点。3.4冠状带裂缘物,形态黄花六道木新拟图3:1,2AbeliaserrataSieb.etZucc,Fl.Japon.I.76.t.34,1835.落叶灌木,高达3m,地径达4cm。树皮灰色,纵裂。小枝栗色,被短柔毛。叶对生,卵形,先端尖至渐尖,基部楔形,全缘或有稀疏锯齿,有缘毛,下面淡绿色。叶片长53±5mm,宽24±3mm,幼时两面有稀疏柔毛,脉上毛较密。侧脉2～3对。聚伞花序1～2花,生于新枝顶端,总花梗2～3mm。花无梗,苞片3枚,长2～3mm,宽不足1mm,披针形。萼筒条形,长约8～10mm,有短柔毛。萼檐2裂,有时其中一枚再深裂而为3枚,长10±1mm,宽6±1mm,矩圆形,先端有裂齿。花冠漏斗状,黄色或黄绿色。花冠筒长18±1mm,口部直径约8mm。花冠裂片半圆形。花冠筒和花冠裂片内面有长柔毛和桔黄色纹。雄蕊4,2强,着生于花冠筒中部,略伸出花冠筒外。花柱细,柱头膨大,高于雄蕊群。花期5月,果期9月。Zhejiang(浙江):Yongjia(永嘉),S.L.Zhou(周世良)andS.T.Lu(陆水土)20006102(PE),S.L.Zhou(周世良)2002519(PE);thesamelocality(同一地点),C.S.Ding(丁陈森)etal.1087(ZJFC),S.L.Zhou(周世良)0473(ZJFC),C.S.Ding(丁陈森)&G.Y.Li(李根有)1241(ZJFC)。分布于浙江省永嘉县四海山(28°30′41″N,120°43′43″E,931m),生于山脊侧面浙江水青冈(FagushayataePalib.exHayatavar.zhejiangensisM.C.LiuetM.H.WuexY.T.Change