分子生物学方法在微生物多样性

分子生物学方法在微生物多样性

及微生物生态研究中的应用

微生物在生物圈的化学平衡中起着十分重要的作用,但我们对于维持这种平衡的微生物生态系统的构造和动力学参数知之甚少.其中最大的原因就是：研究方法的局限性。传统研究方法的局限性传统的研究方法：通过纯培养获得菌株后，对其特性进行描述，即通过其表型特征、细胞的性质(形态学、生理生化反应和细胞组成成分结构的观察)的观察得到其特性。在自然环境中能够纯培养的微生物菌株的数量还不到自然界微生物总数的1%。由于纯培养是检测这些微生物性质的前提,因此这一限制使得自然界的大多数微生物特征很难被具体描述。传统方法得到的性状为微生物进化关系的研究提供的信息很有限,

很难对微生物进行精确分类并构造系统发生树。

DNA杂交技术DNA杂交技术和微生物分子系统学的发展使得我们可以摆脱纯培养条件的束缚,开辟了一条更客观的探索环境中微生物多样性的新思路。理论上讲,微生物间的进化相关性是通过它们各自基因组的核苷酸序列(一级结构)来决定的,对于单个基因的序列比较可以用于比较微生物相对进化关系。典型的方法是比较不同微生物的类似基因并计算它们碱基序列的不同：微生物间的碱基数相差越多,所比较的微生物的进化关系越远。数据用于计算所比较微生物的的进化距离，由此可以建立系统发生树或进化多样性图谱。由于16SrRNA或18SrRNA的基因序列进化变化速率缓慢，所以它们常常被用于以分子生物学技术为基础的系统发生关系的研究.近年来,随着从环境中提取微生物DNA方法的不断改进,以核酸一级结构为依据对微生物进行分类方面的研究获得了长足的发展。现代分子生物学技术用以研究微生物多样性克服了微生物培养技术的限制,能在遗传本质的层面上对微生物群落进行较客观的分析,较精确地揭示了微生物种类和遗传多样性。两界系统理论的建立根据古微生物的化石标本分析,30亿年前出现了自养细菌,20多亿年前出现了蓝细菌,15亿年前首次出现真核生物,即原核生物出现在先,真核生物出现在后。基于以上分析,细胞进化上真核细胞起源于原核细胞。这就是早期生命进化的两界系统理论。此学说认为所有的生命都可以划归这两界之一,而且认为原核生物类似于真核生物的祖先,因而真核生物就是从古代的原核生物进化而来的。“三界”理论的建立近20年来,细胞生物学与分子生物学的大量研究工作表明,原核生物并不是统一的一大类,在极早的时候就已经分化为两大类:真细菌与古细菌。“三界”理论的建立建立在rRNA一级结构信息基础上的系统发生关系的研究表明，原核生物应分为两界：古细菌和真细菌，这两界彼此不同。古细菌、真细菌和真核生物三者之间不存在谁起源于谁的问题,而是相互平行的，三者都起源于共同的祖先,这一祖先称为原始细胞。“三界学说”由此诞生,目前已利用rRNA信息作为标尺建立了系统发生树。古细菌分子遗传学方面的研究表明：古细菌的遗传信息传递机制与真核生物的相似,古细菌与真核生物在进化上的关系较原核生物更为密切，因此近年真核生物起源于古细菌的观点得到了加强，很可能真细菌首先从古细菌和真核生物的共同干线中分支出来。“三界学说”和生命树的定量化提供了一种全新的研究微生物生物多样性的视点,并提示了大多数微生物都具有遗传多样性。

16SrRNA基因序列分析Pace等首次利用rRNA基因确定环境样品中的微生物,通过对5SrRNA基因的序列分析来研究微生物的生态和进化。该方法很快被用于微生物多样性研究领域。由于5SrRNA基因相对较小(约120个核苷酸),携带信息相对较少,因而揭示微生物群落多样性的能力有限。相比之下,随后开展的16SrRNA基因序列(约1500个核苷酸)分析为微生物多样性研究提供了更多信息,且效率更高。16SrRNA为原核生物核糖体中一种核糖体RNA,大小约1.5kb左右.其种类少,含量大(约占细菌RNA含量的80%),分子大小适中,存在于所有的生物中,特别是其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称。16SrRNA既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术来较容易地得到其序列,故被细菌学家及分类学家所接受。细菌的16SrRNA可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，可以利用恒定区序列设计引物将16SrRNA片断扩增出来,利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。通过对其序列的分析，可判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近。16SrRNA基因序列分析是主要基于已建立的微生物16SrRNA基因序列数据库,用以确定细菌的系统发育关系,并使序列探针用于识别未知菌(unculturedmicrobes)成为可能.不少学者利用16SrRNA基因序列分析技术研究了多种环境的微生物多样性,并得到了一些有意义的结果.如海洋中浮游细菌的遗传多样性;不同污染物对细菌群落多样性有显著的作用;农业土壤微生物群落显著生理活性差异及其多样性;氧化光能利用菌群落16SrRNA基因的丰度与其形态型显著相关。一、分子生物学技术的应用随着分子生物学技术的发展,DNA标记技术已成为探讨种群遗传变异的重要选择。从环境样品中提取和纯化总DNA的方法不断得到发展,从而可对环境样品中微生物总DNA进行PCR(polymerasechainsreaction)扩增。遗传多样性检测的分子标记主要包括:限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、DNA扩增指纹分析(DAF)、扩增片段长度多态性(AFLP)、16SrRNA基因序列分析等,目前应用较广的是基于微生物16SrRNA特异性基因序列的标记技术。基于分子杂交技术的分子标记核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术,它是基于DNA分子碱基互补配对的原理,用特异性的cDNA探针与待测样品的DNA或RNA形成杂交分子的过程。由于它的高度特异性和灵敏性,近年来被广泛应用于微生物多样性的研究中。用于微生物多样性研究的探针主要是有双链DNA、单链DNA和RNA以及寡核苷酸探针等三类,可对有关微生物在特定环境中的存在与否、分布模式和丰度等情况进行研究。目前微生物多样性研究中应用较多的是原位杂交技术。对环境样品中提取的DNA作数量印迹杂交(quantitativedotblot),可获得有关特定DNA序列丰度的信息。其主要原理是基于专一性探针(如特定16SrRNA基因探针)、通用型探针(如总16SrRNA基因探针)和环境样品中分离的总DNA可分别进行杂交,其特定DNA(如16SrRNA基因序列)的相对丰度可用此两类探针杂交信号的比值加以确定,用以间接反映特定的微生物细胞的数量或特定种群的相对生理活性等。对rDNA的扩增产物或rRNA的反转录产物作Southern杂交（southernhybridization),其主要原理是基于微生物的rRNA基因的信号序列在不同物种层次上存在差异。根据这些不同层次的信号序列而设计的特定寡核苷酸探针可检测相应微生物的层次。原位杂交对环境样品直接作原位杂交(insituhybridization),是细胞学方法与分子杂交技术相结合的产物：利用荧光标记的具有特异性的核酸片段为探针,与中期细胞的染色体或间期细胞核的DNA杂交,在染色体上或核中显示与探针同源的DNA片段的位置,从而将这段DNA序列定位在细胞中。此技术可获得未知菌的微生物多样性的大量信息,如微生物的形态特征和丰度以及在样品上的空间分布和动态。由于是对环境样品直接进行检测,所以获得的结果理论上应更能反映自然环境下微生物的多样性特征。这种研究成功的关键是前期研究工作的积累,尤其是已具有对属、种或种群等具特异性的DNA探针.如Jain等采用特异性的探针对地下水中的细菌进行原位杂交,研究了细菌有关质粒基因的存在和分布情况;Barkay等研究了汞污染土壤中抗汞细菌的种类、数量和变化趋势等。全细胞杂交对微生物菌落作全细胞杂交(whole-cellhybridization),可提供比用探针作Southern印迹杂交更直观的信息。最初此方法以放射性标记的rRNA基因探针用于镜检单个微生物细胞。Lobet-Brossa等也曾应用荧光标记的rRNA基因探针对海底沉积物微生物群落进行杂交分析。基于PCR技术的分子标记PCR技术是美国科学家Mullis发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,其目的是将极微量DNA进行大量特异性扩增。此技术的原理是将DNA片段经过若干次解链和复性循环,大量扩增，甚至可扩增到十几亿倍,以便于对已知DNA片段进行分析,如基因分析、序列分析、进化关系分析等。目前,在微生物生物多样性领域应用最为广泛的是以微生物的16SrRNA保守性基因为基础设计引物进行PCR扩增,分析基因序列研究微生物群落的多样性。样品来源及模板制备：用以抽提模板DNA的样品只需极少量,且模板也极低,只需几个纳克,抽提过程较为简单,可用经典的DNA或RNA提取法。对称PCR(SymmetricPCR)：根据选用的引物来扩增模板DNA的特异性双链片段.这个过程引物的设计至关重要。若设计不合