植物生理与分子生物学：作物遗传与功能基因研究

作物遗传与功能基因研究<<植物生理与分子生物学讲义>>第一篇：基因与遗传一、遗传学的发展与原理二、分子标记技术与连锁图谱的构建三、遗传群体的构建四、主基因定位与克隆五、数量性状基因座位QTL定位与克隆六、基因间互作与调控网络七、分子育种遗传学的发展孟德尔（Mendel)定律，提出遗传因子分离和重组摩尔根（Morgan)等提出连锁交换定律，基因以直线排列在染色体上Beadle与Tatum提出一基因一酶学说Avery,MacLeod,McCarty与Hershey,Chase等证明DNA是遗传物质Watson与Crick提出DNA双螺旋结构模型开创分子遗传学19世纪末1910年194119441953

遗传基本原理1.分离定律P1XP2红花白花CCccCc红花F1F2红花3:1白花1CC:2Cc:1ccF3红花红花/白花白花2.自由组合定律P1XP2高秆/紫色矮秆/绿色

YYRRyyrrYyRr高/紫F1F2高/紫:高/绿:矮/紫:矮/绿

9:3:3:19Y-R-:3Y-rr:3yyR-:1yyrr

1YYRR1YYrr1yyRR1yyrr2YYRr2Yyrr2yyRr2YyRR4YyRr

适合性测验——2X测验2Xc＝Σ(Oi–Ei-0.5)2Eii红花:白花=3:1F2=929株

红花观察（O1）理论(E1)

705696.75

白花观察（O2）理论(E2)224232.252Xc＝（705-696.75-0.5）2696.75+（224-232.25-0.5）2232.25＝0.345<3.842X0.05=3.84∴样本结果符合理论比3:13.连锁交换ABababXP1P2F1XABABabABabAbaB亲本配子AB亲本配子ab重组型配子AbaB重组率r＝重组配子数总配子数（亲配子+重组配子）X100%两对基因连锁与独立时配子类型及比例配子ABAbaBab连锁(r<0.5)(1-r)/2r/2r/2(1-r)/2完全连锁(r=0)0.5000.5完全独立(r=0.5)0.250.250.250.25交换和重组的主要影响因子着丝粒：异染色质多，降低交换率染色体异常：倒位抑制交换，易位减少重组抑制或促进的基因环境：温度，水分，营养，射线作图函数(mappingfunction)Haldane函数R=-(1/2)ln(1-2r)R为作图距离，单位cM

r=22%

R=-(1/2)ln(1-2x0.22)=0.2929cM

前提：假设完全不发生交换干涉2.Kosambi函数R=(1/4)ln(1+2r)/(1-2r)

r=22%

R=23.6cMcMMarker一、遗传学的发展与原理二、分子标记技术与连锁图谱的构建三、遗传群体的构建四、主基因定位与克隆五、数量性状基因座位QTL定位与克隆六、基因间互作与调控网络七、分子育种水稻经典（形态）标记连锁图形态标记与分子标记比较数量形态标记有限无限分子标记遗传特点显性共显性生理特点致死或不利中性

环境影响是稳定常用分子标记种类RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段长度多态性)

多态性：限制性内切酶位点/位点间DNA区段突变产生RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,随机扩增多态DNA）模板DNA扩增区域上引物结合位点的碱基序列发生突变，引起扩增产物的有无CAPS(CleavedAmplifiedPolymorphicSequence,劈开扩增多态序列）

特异PCR产物DNA序列内限制性内切酶位点变异产生多态STS(SequenceTaggedSite)

扩增基因组的特异序列，有时PCR产物大小有差异产生多态SSR(SimpleSequenceRepeat,MicrosatelliteMarker,微卫星标记）

由2或3个碱基形成重复，次数一般10-50，重复次数的不同,产生多态

SNP

(Single-NucleotidePolymorphism

,单核苷酸多态性）通过对基因组测序，出现单碱基的变化（A,T,C,orG）而产生 的多态性常用分子标记特点RFLP中等共显性低拷贝编码序列cDNA/gDNA连锁框架图类别多态性遗传特点基因组分布探针/引物用途CAPS中等共显性整个基因组16-20bp连锁框架图图位克隆,应用多SSR高共显性整个基因组16-20bp连锁框架图基因定位，应用多RAPD较高显性整个基因组10bp早期应用连锁框架图，现在少用SNP极高共显性整个基因组GWAS全基因组关联分析STS中等共显性整个基因组16-20bp连锁框架图图位克隆，应用多常用分子标记检测技术-1RFLP基因组总DNA限制性内切酶酶解电泳转尼龙膜用同位素或生物素标记Probe进行DNA杂交检测多态性MarkerNameR753Amplifiedbandsize(bp)1200EnzymeAfaI5'primer5'GAGTTGCATGACATAAAGCC3'3'primer5'GAACAAAAGGATGGCAGCAG3'RGP常用分子标记检测技术-2CAPS常用分子标记检测技术-3e-CAPSKoshihikariNona（i）比较国际协助组的日本晴（粳稻）序列与华大的9311（籼稻）序列CAPS251/MluIEnzymesite(MluI)日本晴93111.8kb1.6kbHomo.ACAGAGTAGGAGGCAAAC……………GTCACGCGTAAC……………GCTACTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAAC……………GTC

CGCGTAAC…………..GCTACTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAAC……………GTCGCGCGTAAC……………GCTACTTACACGGACA1.63kbno

enzyme

site0.2kb（ii）PCR，电泳F2populationPrimerPrimerKosh.NonaF2populationSTS1102/PCR

2.2kb1.8kb

ATTATCTCCGCTATTTCC……………CTACCATCATAAGTTTCTTATGT------------------------------------------------------------------------------------------------

ATTATCTCCGCTATTTCC……………CTACCATCATAAGTTTCTTATGT

ATTATCTCCGCTATTTCC……………CTACCATCATAAGTTTCTTATGTCATCGTTGGAACTTGGAACCAACAGGTGGCCACTAGCAATTACACTTTGGATA----------------TCCTATCAG-----------------------------------ATTTTT---------------------------------------------------------------------------------------------------------------GATATTCAAGCATCAAAATTCCAATCAAAACTTTAGTTTATTTTTTCTTTTAAAAAAATGACTGCAAGTTTCGAAAATTGTACTAGCAAAGAAAAAAAAA---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ACGATCTAAAGACAATCCTAAGGGTTGGGCTAAAAATTTGTCAACCAACTGACCATAGAAAACAAGCAGAAGTAGGCCACATAGAGCTAATTTGGAG--------TTTTTGGGCTAGCCGCCAAGGTGAGGTCGATTCATTGGCAGACGCGGAACAGATCTGGA………….AACGACTACTCGGATCAT

TTTTTGGGCTAGCCGCCAAGGTGAGGTCGATTCATTGGCAGACGCGGAACAGATCTGGA…………AACGACTACTCGGATCATACAATTTTTGGGCTAGCCGCCAAGGTGAGGTCGATTCATTGGCAGACGCGGAACAGATCTGGA………...AACGACTACTCGGATCATDeletionNipo9311PrimerPrimerhomoDeletione-STS常用分子标记检测技术-4常用分子标记检测技术-5SSRGCTGTACAGTGTCTTCGTTTCTGCCTATTGCCTACTCACTCTSACBMarkerRM1068F2PopulationTSA籼稻CB粳稻重复12次重复20次GCTGTACAGTGTCTTCGTTTCTGCCTATTGCCTACTCACTC常用分子标记检测技术-6SNP分子标记连锁图谱的构建1.遗传群体如F2群体2.分子标记如RFLP，SSR3.作图软件如MAPMAKER分子标记连锁图谱的构建F2群体PlantNo.1234567891011…186*T175*T93*C35*T24*C66*T209*T50B*T125*T83*T17*M200ABHBHHAHBHA…HBBABHHBHBHA…BBBABHHBHBHA…BAHBHHAHHHHB…HBH-BAHAAHBH…HABABHHBHBHA…AABHHHAHHHHB…BBAHHAHAAHBH…HABHBHHAHHHA…BBHHBABAAHHH…H………AHBHHAHAHHB…HExcel,Word;格式raw；文件名：f2A＝P1纯合基因型；B＝P2纯合基因型；H＝杂合基因型datatypef2intercross1862000分子标记连锁图谱的构建作图软件如MAPMAKER使用**************************************************************************OutputfromMAPMAKER/EXP(version3.0b)ThuMay0512:54:542006*****************************************************************************'photo'ison:fileis‘F2.OUT'1>photof22>pdf2preparingdatafromfile‘f2.RAW'...okF2intercrossdata(333individuals,12loci)...oksavinggenotypedatainfile‘f2.DAT'...oksavingmapdatainfile‘f2.MAP'...oksavingtraitsdatainfile‘f2.TRA'...ok3>centfunckosamcentimorganfunction:Kosambi4>sallsequence#1=all5>groupLinkageGroupsatminLOD3.00,maxDistance37.2group1=12357-------group2=46891011126>s12357sequence#2=123577>orderLinkageGroupsatminLOD3.00,maxDistance37.2order1=13257other1=8>s13257sequence#3=132579>m====================================================Map:MarkersDistance1T1754.0cM3C3513.3cM2T9310.7cM5C6611.0cM7T50B----------39.0cM5markerslog-likelihood=-424.94====================================================10>s4689101112sequence#4=468910111211>orderLinkageGroupsatminLOD3.00,maxDistance37.2order1=1069128114

other1=12>s1069128114sequence#5=106912811413>m====================================================Map:MarkersDistance10T1723.4cM6T20915.7cM9T8320.1cM12T7116.3cM8T1256.0cM11C1513.1cM4T24----------94.6cM7markerslog-likelihood=-688.99====================================================14>save15>qMap:MarkersDistance1T1754.0cM3C3513.3cM2T9310.7cM5C6611.0cM7T50B----------39.0cMMap:MarkersDistance10T1723.4cM6T20915.7cM9T8320.1cM12T7116.3cM8T1256.0cM11C1513.1cM4T24----------94.6cM0.0T1754.0C3517.3T9328.0C6639.0T50BcMMarker0.0T1723.4T20939.1T8359.2T7175.5T125cMMarker81.5C1594.6T24绘制连锁图分子标记连锁图的构建http://rgp.dna.affrc.go.jp/publicdata/geneticmap98/geneticmap98.html分子标记连锁图的构建Nipponbare/KasalathF2:186株2275markerloci1521.6cM0.67cM(平均图距）分子标记在基因定位中的应用1.主基因（Majorgene)定位2.数量性状基因座位（QuantitativeTraitLoci,QTL)定位(1)构建遗传群体,F2(2)构建分子标记连锁框架图(3)根据在遗传群体中相关性状的表型推测目标基因的基因型(4)连锁分析定位目标基因(1)构建遗传群体,F2,RIL,NIL(2)构建分子标记连锁框架图(3)对遗传群体的每个体（系）的目标性状进行表型测量(4)对分子标记数据与表型数据进行统计分析，定位QTLs一、遗传学的发展与原理二、分子标记技术与连锁图谱的构建三、遗传群体的构建四、主基因定位与克隆五、数量性状基因座位QTL定位与克隆研究六、基因间互作与调控网络七、分子育种各种类型遗传群体的构建-1两个亲本的选择原则：亲本间DNA多态性高（如亲缘较远的籼稻品种与粳稻品种）；亲本纯度高；杂交后代要有一定的育性2.群体类型：

暂时性群体：F2,BC1等，经自交个体的基因型会变化，不能永久使用

永久性群体：

RIL(RecombinantInbredLines,重组自交系）

DH(DoubledHaploid,双单倍体）

NIL（NearlyIsogenicLine,近等基因系)CSSL(ChromosomeSegmentSubstitutionLine,染色体片段置换系)

由许多株系组成，不同株系间存在基因型差异，株系内基因型纯合，自交不分离，可永久使用各种类型遗传群体的构建与遗传结构-2F2BC1P1P2XF11234520067P1P2ABHHABHHHBGenotypesP1XCAPS251AHHHHAHAA:H:B=1:2:1A:H=1:11234520067⊕各种类型遗传群体的构建与遗传结构-3F2P1P2XF1F2F3F4F8纯合度＝1-(1/2)^8

=99.61%LineNo.12345678910200A:B=1:1GenotypesAA

BABBAABABRIL（重组自交系）P1P2RA1962/EcoRIAB⊕各种类型遗传群体的构建与遗传结构-4DH(DoubledHaploid,双单倍体）P1P2XF1花药培养单倍体双单倍体（DH）自然加倍秋水仙素处理株系号12345678910200GenotypesABBABBAABABM1M2BBAAABBBABAA:B=1:1纯合度≈100%各种类型遗传群体的构建与遗传结构-4NIL（近等基因系)437891011121TargetRegion256F1XBC1F1XBC5F1选育近等基因系(NIL)基因功能分析MASBC5F2P1P2XP1P1MAS(Marker-assistantselection)P2P1CSSL(染色体片段置换系)(ChromosomeSegmentSubstitutionLine)各种类型遗传群体的构建与遗传结构-4F1XBC1F1XBC3F1选育CSSL(染色体片段置换系)MASBC3F2P1P2XP1P1MASchr1chr2chr3chr4chr5chr6Line1Line2Line3Line4Line5Line6Line7Line8Line9Line10Line11Line20Line21Line22Line23Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.6Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10Chr.11Chr.12CSSLTheCSSLscoveringwholeindicavarietygenomeinelitejaponicavarietybackgroundRedbarindicateschromosomesegmentsoftheNona,non-colorandgraybarindicatechromosomesegmentsoftheKoshihikariandtheheterozygous,respectively覆盖整个基因组的染色体片段置换系（Chromosomesegmentsubstitutionlines，CSSL）是作物重要性状的遗传及功能基因组研究的重要基础遗传材料，其可以在基因组水平快速、高通量定位各种基因或QTL，是自然基因位点变异的突变库，类似人工诱变的突变体库。以与栽培稻亲缘远的不同稻种作供体亲本，以优良水稻品种作为轮回亲本，利用分子标记进行辅助选择，构建外来种染色体片段置换系，即将外来种的各种染色体片段导入优良水稻品种（遗传背景为优良水稻品种）中。CSSL(染色体片段置换系)用途几种常用遗传群体的特点群体构建所花时间遗传特点用途F2短双亲纯合基因型与杂合型，不能重复使用连锁框架图，基因定位RIL/DH长/较短双亲纯合基因型，无杂合型，永久使用连锁框架图，基因定位尤其QTL定位，剔除环境影响，增加精确度NIL长

短的目标区域为供体纯合基因型，其它绝大部分区域为轮回亲本基因型，永久使用高精确度定位QTL基因，研究QTL基因功能CSSL长长的目标区域为供体纯合基因型全基因组快速定位基因（QTL）一、遗传学的发展与原理二、分子标记技术与连锁图谱的构建三、遗传群体的构建四、主基因定位与克隆五、数量性状基因座位QTL定位与克隆六、基因间互作与调控网络七、分子育种1.整群体定位方法2.近等基因池（pool）方法定位基因3.全基因组测序方法PlantNo.12345678910192S869BA

A

H

H

B

H

B

A

H

HC11368B

H

A

B

H

H

A

H

B

A

AM120AB

A

B

B

H

A

H

A

A

AF2Wildspl7X1.整群体定位方法（Mappingofricespotted-leafgene,Spl7）Spl7B

D

D

B

D

D

D

D

B

D

DABD=AorHC11084S869

C11368Spl7S15906MAPMAKER作图软件2.近等基因池（pool）方法定位基因Wildspl7XF2200株选择wildtype单株15-20株DNA均等混合Pool-W(P-W)选择mutanttype单株15-20株DNA均等混合Pool-M(P-M)全基因组筛选P-W与P-M多态分子标记（120个）多态分子标记Wildspl7P-WP-M与基因spl7连锁R206分析F2群体验证定位结果窄叶突变体M2和野生型基因组DNApool、亲本A和B分别在连锁区段附近的分子标记带型。16个窄叶突变单株基因组DNApool的为B，16个野生型单株基因组DNApool的为H，偏向A。窄叶突变体M2和野生型单株、亲本A和B分别在连锁区段附近的分子标记带型。窄叶突变体单株多为B亲本带型，有少量杂合带型；野生型则为A亲本带型和杂合带型。2.近等基因池（pool）方法定位基因WTMTP-MTP-WT窄叶突变体单株野生型单株Pool定位3.全基因组测序方法：新一代测序技术对近等基因池(pool,bulkedDNA)DNA进行全基因组测序快速定位基因Figure1SimplifiedschemeforapplicationofMutMaptorice.Aricecultivarwithareferencegenomesequenceismutagenizedbyethylmethanesulfonate(EMS).Themutantgenerated,inthiscaseasemidwarfphenotype,iscrossedtothewild-typeplantofthesamecultivarusedforthemutagenesis.TheresultingF1isself-pollinatedtoobtainF2progenysegregatingforthemutantandwild-typephenotypes.Crossingofthemutanttothewild-typeparentallineensuresdetectionofphenotypicdifferencesattheF2generationbetweenthemutantandwildtype.DNAofF2displayingthemutantphenotypearebulkedandsubjectedtowhole-genomesequencingfollowedbyalignmenttothereferencesequence.SNPswithsequencereadscomposedonlyofmutantsequences(SNPindexof1;seetext)arecloselylinkedtothecausalSNPforthemutantphenotype.Abeetal.,NatBiotech,2012,

30:

174–1783.全基因组测序方法：新一代测序技术对近等基因池(pool,bulkedDNA)DNA进行全基因组测序快速定位基因Abeetal.,NatBiotech,2012,

30:

174–178SNP:1,001(Hit1917-pl1);

1,339(Hit0813-pl2)SNPindex:10(CG)/20=0.5;20(TG)/20=13.全基因组测序方法：新一代测序技术对近等基因池(pool,bulkedDNA)DNA进行全基因组测序快速定位基因Abeetal.,NatBiotech,2012,

30:

174–178SNP-22981826waslocalizedtothegeneencodingchlorophyllideaoxygenase(OsCAO1)leadingtoaL253Fmutation(CTT→TTT).Strategyofmap-basedcloningchromosomeGeneticlinkagemapGenomicDNAclonesDNAmarkerTargetgeneFine-scalegeneticanalysisusinglargepopulation>3000GenomiccloninganalysisComplementarytest★★★★Mappingofgene★PAC/BAC≈120Kb<10Kbcandidategene主基因定位与克隆整群体定位方法Wildspl7XF2C11084C466S2678S869

C11368S2581S1762S1831B344Spl7S15906C2782AR2781132298plantsChr5,S869C11368S2581R27812944plantsY3824cRP435B7TP461H4TSpl7C11368BP693G10SC11368AY4666RP29H1TP416E1T81774Map-basedcloningofricespotted-leafgene,Spl7例1主基因克隆Yamanouchietal.2002,PNASY3824cRP435B7TSpl7C11368BY4666RP29H1TP416E1T81774P461H4TP693G10S051015kbS12C1-1S12C3-3S12C4-4aS12C4-4bS12C6-6aS12C6-6bS12C6-6dHsfC2-1Spl7HsfC3-3'C11368C4-2candidateregion

NspV-BglII5.6kbComplementationTestMap-basedcloningofricespotted-leafgene,Spl7Yamanouchietal.2002,PNASP693G10SC11368AP461H4TSpl7issimilaritytotheheatstresstranscriptionfactorgene,hsfComparisonbetweensequencesofwidegeneandmutantgene,onlyonesingle-basesubstitutionswasfoundTGGTGTNormalSpl7Mutant

spl7W(Trp)C(Cys)Spl7

的功能分析Yamanouchietal.2002,PNAS中花11EMS突变体，9000株系，27万单株水稻抗旱耐盐突变体dst(droughtandsalttolerance)抗逆基因DST的定位与克隆及功能分析水稻抗旱耐盐突变体dst的筛选150mMNaCl处理13天处理前例2主基因克隆突变体dst表现抗旱性强01020304050607000.511.522.533.544.55Time(hour)Waterloss(%FW)ZH11dst020406080100012244872Time(hour)RelativewatercontentZH11dst20%PEG4000PEG0dPEG7dPEG24dRecovered10d中花11(ZH11)中花11(ZH11)中花11(ZH11)dstdstdst处理前干旱处理12天断水处理20天后恢复15天ZH11dstZH11dstZH11dst突变体dst表现抗旱性强Drought,0dDrought,12dDrought,15dDrought,15dRecovered,30dZH11dst突变体dst表现抗旱性强突变体dst表现耐盐性强140mMNaClRootShootDaysaftertreatmentNa+content(µmolmg-1)0.00.20.40.60.81.01.2ZH11dst*****K+content(µmolmg-1)0.00.20.40.60.81.01.20707ZH11dst***RootShootDaysaftertreatment0707NaCl0dNaCl12dNaCl12dRecovered10d中花11(ZH11)dst中花11(ZH11)dst中花11(ZH11)dstCompletelyclosePartiallyopenCompletelyopencompletelyclosepartiallyopencompletelyopenZH11dstPercentageofthreetype

stomata(%)020406080100ZH11dstStomatalconductance(molH2Om-2s-1)00.050.100.150.200.250.30**ZH11dstNumberofstomatapermm2050100150200250**突变体dst增加气孔关闭、降低气孔密度monocotyledonABCZH11dstD*11.011.512.012.513.013.514.0leaftemperature(ºC)

ZH11dstZH11dstZH11dst野生型和dst突变体叶片表面温度的差异

01020304050ZH11dstH2O2content(nmolgFW-1)*ZH11dst05001000150020002500ZH11dstMeangrayvalue**ZH11dst突变体dst引起H2O2的累积ZH11dstABAcontent(nggFW-1)051015202530100kbH697H2275H2291H2357H2423H2437H2519H2600H2833H3050H3561014913110357H2734-1H33421110kbH2423H2433H2437H2441H2445H2479H2492H251930556810n=310n=3,725NLSZincfingerdomain(C2H2)N69DA162T5ZH11dst52-526-441-373-10dPEG10dNaCl15dVectorComplementedRNAiZH11dstVectorM1M2MComplemented0dPEG15dNaCl20dDSTDST的定位克隆DSTActinZH11dst41-373-1RNAiDSTZFP1ZFP2ZFP5ZFP8SGT1SUPERMANRAMOSA1LIF****RLFPCLFCNKKFLKSQALGGHQNAHKKERSIGRVFSCNYCQRKFYSSQALGGHQNAHKRERTLARVFSCNYCQRKFYSSQALGGHQNAHKLERTLAKRHECQYCGKEFANSQALGGHQNAHKKERLKKRRFECHYCFRNFPTSQALGGHQNAHKRERQHARRFECQYCCREFANSQALGGHQNAHKKERQQLRSYTCSFCKREFRSAQALGGHMNVHRRDRARLSSYTCGYCKKEFRSAQGLGGHMNIHRLDRARLKSYECNFCKRGFSNAQALGGHMNIHRKDKAKLDST

encodesapreviouslyunknownzincfingerproteinProDST::DST-GFPPEG00.20.40.60.81.01.2Relativeexpressionlevel00.5312244872Time(hour)NaCl00.40.81.21.62.000.5312244872Time(hour)RelativeexpressionlevelDST主要在微管组织表达，在气孔也表达DST的表达早期受到胁迫的抑制35S∷GFPGFPBrightfieldMerged35S∷DST-GFPGFPBrightfieldMerged35S∷DST-GFPNon-transgenicplant05101520pADpGBKT7pDSTpDST-M1pDST-M2pDST-MRelativeβ-galactosidaseunitsaaabccDST定位于细胞核DST是有转录激活活性的转录因子B3ATGCTAGAATTGCCCCTTM1CCGCTAGAATTGCCCCTTM2ATTTTAGAATTGCCCCTTM3ATGCGGGAATTGCCCCTTM4ATGCTAACATTGCCCCTTM5ATGCTAGACCTGCCCCTTM6ATGCTAGAATCTCCCCTTM7ATGCTAGAATTGAACCTTM8ATGCTAGAATTGCCAATTM9ATGCTAGAATTGCCCCCCM10ACTCTAGAATTGCCCCTTM11ACTCCCGAATTGCCCCTTM12ACTCCCGACCTGCCCCTTM13CTGCTAGAATTGCCCCTTM14ATGATAGAATTGCCCCTTM15ACTAGGGAATTGCCCCTTM16ATGCTAGACCCTCCCCTTM17ACTAGGGACCCTCCCCTT5’12bits01234567893’His200×FPHis-DST*---10×50×100×CompetitorDNAghHis-DSTFPHisB3Mutant123456789101112**His-DSTFPHisB3Mutant1314151617B3:B4:B62:B72:B78:B82:ATGCTAGAATTGCCCCTTCTGTGATAGTATACCGGTTGCTAAGATTGTACACTCCGTGATATGTTAAACCAATGTTAACTTTCTAATACTCTGCTAAGATTTATTGTEMSA实验证明DST结合的顺式元件：TGCTANNATTG

FP010501000110mMEDTA1,10-o-phenanthroline**HisFPHis-DSTHis-DST-MHis-DST-ΔZFHisZFN69DA162THis-DSTHis-DST-MHis-DST-ΔZF17013095725543342617His-DSTHis-DST-MHis-DST-ΔZFHisMarker(kDa)DST的锌指结构域结合顺式元件InputPeroxidase24precursorOsGSTU2CytochromeP45071D10CytochromeP45094A2ActinNoAbAnti-DSTHisHis-DST-+-----+--++Peroxidase24precursorCytochromeP45071D10Peroxidase24precursorGlutathioneS-transferaseCytochromeP45071D10CytochromeP45094A2ActinWTdstEMSAChIPRT-PCRDescriptionGeneNumunknownprotein24other22redoxgenes9transcriptionfactor2signaltransduction3Total60redoxgenesAnnotationFold(log2)Peroxidase24precursor-3.94GlutathioneS-transferaseGSTU6-3.38Lignostilbene-alpha,beta-dioxygenaseandrelatedenzymes-2.77CytochromeP45071D10-2.30CytochromeP45094A2-2.07Peroxidase12precursor-1.63Acyl-CoAdehydrogenase4.73GlutathioneS-transferaseGSTU65.79Peroxidase16precursor8.87DSTtargetgenesbyAffymetrixRiceGenechipDST直接结合与H2O2homeostasis

的相关基因，并调控相关基因的表达00.020.040.060.080.100.120.140.160.18051015202530354045505560Time(min)Absorbance(560nm)HRP6xHis-PRX6xHis00.51.01.52.02.53.06xHis6xHis-PRXRelativeactivity(μUml-1pmol-1)**00.20.40.60.81.01.21.4RelativeexpressionlevelZH11dst****GCPMCPLeaf00.20.40.60.81.01.21.41.61.8MCPGCP**Relativeexpressionlevelmesophyllcellprotoplast(MCP),guardcellprotoplast(GCP)Peroxidase24precursor:PRX00.51.01.52.02.500.5312244872Time(hour)RelativeexpressionlevelNaClPEGPeroxidase24precursorPEG00.20.40.60.81.01.2Relativeexpressionlevel00.5312244872Time(hour)DST受DST调节的H2O2homeostasis

相关基因(如Peroxidase24precursor:PRX)，具有还原H2O2能力，并在气孔中受到DST的调控Peroxidase24precursor的表达也受到胁迫的抑制，与DST类似00.51.01.52.000.531224Time(hour)RelativeexpressionlevelaaaaaABA020406080100Percentageofthreetypestomata(%)completelyclosepartiallyopencompletelyopenZH11dstComplementedRNAi52-573-1DST可能独立于ABA，参与调控抗旱耐盐ABA024681012ZH11dstPaniclenumberperplantP=0.0050051015202530ZH11dstPanicleweightperplant(g)P=0.47020406080100ZH11dstSeedsetpercentageofmainpanicleP=0.520.00.51.01.52.02.53.0ZH11dst100-grainweightofmainpanicle(g)P=0.100510152025ZH11dstMainpaniclelength(cm)P=0.00016050100150200ZH11dstGrainnumberofmainpanicleP=0.42抗旱耐盐增强的dst突变体没有明显降低产量，表明DST基因有应用价值DBSDSTDroughtandsaltstressGenesrelatedtoH2O2homeostasise.g.Peroxidase24precursorH2O2accumulationStomatalclosureDroughtandsalttoleranceABA建立了DST参与抗旱耐盐的分子调控新途径Huangetal.,Genes&Development,

2009,23(15):1805-1817

Pham,etal.,SignalingandCommunicationinPlants,2009Huangetal.,Genes&Development,

2009ABAROS(e.g.H2O2)NOCa2+DST一、遗传学的发展与原理二、分子标记技术与连锁图谱的构建三、遗传群体的构建四、主基因定位与克隆五、数量性状基因座位QTL定位与克隆六、基因间互作与调控网络七、分子育种克隆QTL对于阐明作物重要性状的遗传调控机理以及育种改良均具有重要意义作物性状数量性状（耐盐、抗旱、产量）质量性状（抗病、抗虫）单个主基因控制多个数量性状基因（QTL）控制0102030405020222426283032343638盐胁迫下水稻苗生存天数株系数P1P2克隆基因或QTL，阐明分子机理；育种应用31:SalttoleranceDrought/RecoveredYieldtraitsQuantitativeTraitLocus(QTL)数量性状基因座位QTL定位0102030405020222426283032343638TraitNo.ofplantsKNQTL定位重要性许多作物的重要性状是由多个QTL控制的数量性状，为连续分布，如产量，品质，抗逆性等通过QTL分析可以了解重要性状的遗传机制与普遍存在的自然变异为克隆QTL奠定基础4.利用与QTL紧密连锁的分子标记可以进行分子标记辅助育种，加快育种改良进程TakedaandMatsuoka,NatRevGenet9:444-457,2008数量性状基因座位QTL定位1.Linkagemapping

2.Associationmapping3.SelectionscreeningStresstolerantStresssensitiveSNPNucleotidediversityNucleotidediversityComparisonofSNPallelefrequenciesQTL定位方法1.Linkagemapping

Map-basedcloning2.Associationmapping(GWA:Genome-WideAssociationmapping)

LinkagedisequilibriummappingF1F2,BC1,RIL,DH构建分子标记连锁图谱评价数量性状初步定位QTLP1BC1F1XP1BC2F1orBC3F1建立大规模群体克隆QTL

图位克隆QTL（Map-basedcloning)技术路线高精确度连锁分析EST，CAPS，STS，SSR；基因组序列XP1BC5F2选育近等基因系(NIL)结构与功能分析MASMAS遗传互补试验

P1P2XX1.QTLmappingLinkagemapping数量性状基因座位QTL定位方法1.方差分析ANOVA2.QTL定位原理-区间作图法(Intervalmapping)3.CSSL(染色体片段置换系)分析1.QTL定位原理-方差分析ANOVA0102030405020222426283032343638TraitNo.ofplantsKNF2,BC1,RIL,DHP1P2XM6(P1/P1)QTLAM6(P1/P2)QTLHM6(P2/P2)QTLBA平均值H平均值B平均值方差分析PlantNo.12345678910192CA1571BA

A

H

H

B

H

B

A

H

HC039B

H

A

B

H

H

A

H

B

A

AM120B

H

A

B

H

H

A

H

B

A

ACA1571株高178.5

67.5

81.0

137.0145.0

159.0

147.0

168.0

90.0

157.0

147.0

QTL定位原理-方差分析ANOVA实例ABHMeanS2MeanS2MeanS284.6744.6

166.1424.0144.3389.0C039131.81654.1131.31500.1137.51452.0F=4ST2SA2SB2SH2++23.110.99**F0.05=1.29F0.01=1.43F2,BC1,RIL,DHP1P2X2.QTL定位原理-区间作图法(Intervalmapping)LOD=logofoddsLOD=log10L(uj,σ2,y1,y2,…yn)L0(up,σp2,y1,y2