全内反射荧光显微成像技术

全内反射荧光显微成像技术

长寿的发展要求研究人员从单分子层面观察细胞生命活动的细节，进一步揭示生命活动的过程。目前,国际上公认最具前途的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、激光共聚焦显微术、近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术。全内反射荧光显微术(TotalInternalReflectionFluorescence,TIRF)是近些年来新兴的一种光学成像技术,该技术利用全内反射时产生的隐失波照明样本,使照明区域限定在样品表面薄层范围内,有效控制了激发体积,因此具有其它光学成像技术无法比拟的高信噪比和对比度。21世纪80年代,Axelrod等生物物理学家对全内反射荧光显微术进行了描述并探索了其生物学应用。20世纪90年代,随着新型的物镜透镜和超灵敏探测器的出现,该技术得到了充分的发展。目前,该技术已被广泛地应用于生物化学、细胞生物学以及其它研究领域。一、原理1.sell定律当一束光线经过两个不同折射率的介质时,部分光线会于介质的界面被折射,其余的则被反射。入射角和折射角的关系满足Snell定律:当光线由光密介质(如玻璃,n1=1.5~1.7)进入到光疏介质(如水,n2=1.33)时,当入射角θ1逐渐增大至某一程度时,折射角θ2恰好为90°,该入射角称作临界角θc,依据Snell定律得出:当入射角θ1大于临界角θc时,光线则不再透射入光疏介质,而是在临界面被全部反射,即发生了全内反射(如图1所示)。2.隐失波照明的成像原理当一束光线穿过两种不同折射率的介质(以玻璃与水为例),并且发生全内反射现象时,从几何光学的角度来看,光线会在玻璃与水的临界面上发生完全反射而不进入水溶液中。但实际上,由于波动效应,有一部分光的能量会透过临界面渗透到水溶液中,平行于界面向水溶液中的传播,这一部分透过的能量场则称之为“隐失波”(或“隐失场”)。隐失波的频率与入射光线的频率相同,其强度随临界面的垂直距离呈指数衰减:其中:I(z)表示距离界面Z处的强度;I(0)表示临界面处的强度。隐失波穿透样品的深度d,则与入射光线的波长和角度有关(如图2所示):其中:d表示隐失波穿透深度;λ0表示入射光线波长;θi表示入射角度。由于隐失波仅沿着临界面极薄的一层范围内传播,所以利用隐失波照明样本,可以仅激发紧贴近盖玻片的一薄层范围内(大约100nm~300nm)的荧光基团,而更深层溶液中的荧光基团不被激发,因此极大地提高显微成像的信噪比和对比度。使得所呈图像的Z轴方向的分辨率得到了显著改善。二、物镜的配置应用到目前为止,科学家们已经研制出了多种全内反射荧光显微成像系统,其中最为常用的是两种类型:棱镜型和物镜型(如图3所示)。在棱镜型全内反射荧光显微镜系统中,入射光通过棱镜进入玻璃/水溶液界面,在另一侧的显微镜物镜收集荧光团所发射的荧光。棱镜型系统只需要有激光光源、棱镜和显微镜,即可根据使用者的需求来配置显微镜。其优势在于,从实现的角度来看相对简单、成本较低,从探测角度来看,不易受入射光源信号的影响,所以其成像的信噪比较高。但是由于放置样品的空间受到棱镜的限制,所以不利于进行活细胞或组织的研究。在物镜型全内反射荧光显微镜系统中,物镜既作为发生全内反射的光学器件,同时又作为收集样品荧光信号的接收器。由于细胞的典型折射率为1.33~1.38,因此要实现全内反射,则要求使用数值孔径(N.A.)较高的物镜,即:其中:n、θ分别为物镜的折射率(浸没油)和孔径角,θc为发生全内反射时的临界角。所用物镜的数值孔径越高,则有更多的孔径范围可被利用,且更易于校准光束,而这对制造工艺的要求也就越高。在物镜型系统中,解决了棱镜型系统中样品空间限制的问题,不仅更适用于活细胞的观察,也有利于与其它技术相结合,所以具有更广阔的生物学应用前景。三、z轴上的荧光切片成像技术细胞内很多至关重要的生命活动过程都是在细胞膜表面完成的,例如信号转导、蛋白质转运、病原体侵入等。所以直接观察细胞膜表面的生命活动过程,对于生物化学和细胞生物学研究来说具有极其重要的意义。利用全内反射荧光显微术,可以仅激发深度在100nm~300nm薄层范围内的荧光基团,而不受其它层面的荧光信号的干扰,与其它光学切片成像技术相比其在Z轴上的分辨率独具优势,因此该技术现已成为用于研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术之一。全内反射荧光显微术在生物化学和细胞生物学中的应用主要体现在以下几个方面:选择性观察细胞与基底面接触区域;对贴近支持物表面的单分子荧光的观察和光谱分析;观察活细胞分泌过程中分泌颗粒的运动轨迹;胞外或胞内蛋白与细胞表面受体或人工合成膜结合的动态观察;对活细胞的微形态学结构和动力学分析;对培养细胞发育过程进行长时间荧光观察等。鉴于全内反射荧光显微术的特点,该技术在单分子研究方面的贡献尤为突出。在过去十几年内,该技术已被科学家们广泛地应用于分子马达的运动、活细胞中单分子成像、生物大分子的相互作用、生物大分子的构象变化、ATP酶反应、单分子的电子转移反应等研究领域。四、发展活细胞观察生命科学的发展离不开技术的创新与发展,全内反射荧光显微术经过十几年的迅速发展,现已成为生物单分子研究的必备工具之一。在未来一段时间内,随着高灵敏度、高采集效率荧光探测器的不断发展,必将使该技术在活细胞观察方面的优势得到更充分的发挥。近些年来,人们也逐渐开始关注双色或多色全内反射荧