何首乌中二苯乙烯苷分离纯化工艺研究

何首乌中二苯乙烯苷分离纯化工艺研究

0理化性质及保健功能乌尔是蓼科植物的干燥部位。这是一种调理药。其主要功能成分为2、3、5、4-4羟基二苯基-2-o-d-葡萄糖苷（以下简称二苯基丁基）。药理分析表明,二苯乙烯苷具有显著降低血脂、降低血浆胆固醇和防止脂肪肝、防止肝功能损害的作用[1~3],同时在改善记忆、保护大脑等方面还表现出独特的生理保健功能[4~6]。近年来,天然药用植物中活性成分正成为国际医药食品界的研究热点,而且我国保健食品行业发展态势迅猛,这为天然药用植物的综合开发提供良好机遇和巨大市场。本研究旨在将聚酰胺柱层析技术应用于何首乌中二苯乙烯苷的分离纯化,为综合开发利用何首乌等天然药用植物资源提供新方法和初步理论基础。1材料和方法1.1聚酰胺的合成制何首乌提取液(二苯乙烯苷含量为0.115mg/mL),实验室制备;聚酰胺(30-60目),上海新量化工试剂有限公司提供;体积分数95%乙醇(分析纯),宜兴市展望化工试剂厂产品;体积分数95%食用乙醇,合肥工业大学化学试剂厂产品。1.2膜玻璃层析柱756型紫外分光光度计,上海第三分析仪器厂产品;定制玻璃层析柱;电热真空干燥箱,上海实验仪器厂产品;TGL—16型台式高速离心机,金坛市国旺实验仪器厂产品。1.3方法1.3.1聚酰胺吸附剂的预处理称取适量聚酰胺干粉,置于烧杯中,加入适量食用乙醇溶液,以充分溶胀聚酰胺粉。1.3.2沉降均匀干将充分溶胀的聚酰胺吸附剂缓慢倒入玻璃层析柱,使其沉降均匀。待沉降到所需柱高时,继续用4~6倍柱床体积的食用乙醇淋洗,以平衡层析分离柱,直至洗出液加蒸馏水没有浑浊为止。1.3.3洗脱溶剂的制备在每次试验中,量取20mL何首乌提取液自玻璃层析柱顶端开口处小心缓慢加入,以不搅动床层为准,静置吸附一段时间,待样品完全渗入吸附柱后,再打开收集旋塞开始收集。保持洗脱剂在适当高度,以控制柱压力;以一定量食用乙醇溶液进行洗脱,每50mL分布收集洗脱液,检测洗脱液中二苯乙烯苷的纯度和洗脱率;合并收集所有的洗脱液,并浓缩成50mL的洗脱浓缩液。1.3.4测试指标1.3.5上清液配制将提取液在离心机转速为7200r/min下,离心10min,然后移取上清液并置于烧杯中,放入真空干燥箱中烘干,以适当的比例稀释并定容。在305nm波长下,检测其吸光度,含量计算参照千梅等人的检测方法。1.3.6不同体积分数的食用乙醇洗脱量取何首乌提取液20mL,上玻璃层析柱,柱高40cm,静置10min,然后分别以0%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%等不同体积分数的食用乙醇进行洗脱,洗脱流速为1.5mL/min,其余按1.3.5处理。1.3.7不同食用乙醇洗脱溶剂洗脱速率的测定量取何首乌提取液20mL,上玻璃层析柱,柱高40cm,分别静置5,10,20,30,40,50,60min,然后分别以体积分数70%食用乙醇为洗脱剂进行洗脱,洗脱流速为1.5mL/min,其余按1.3.5处理。1.3.8洗脱溶剂流速的确定量取何首乌提取液20mL,上玻璃层析柱,柱高40cm,静置吸附30min,然后用体积分数70%的食用乙醇为洗脱剂,分别以0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mL/min流速进行洗脱,其余按1.3.5处理。1.3.9洗脱溶剂用量及洗脱温度量取何首乌提取液20mL,上玻璃层析柱,柱高分别为40,50,60,70cm,静置吸附30min,然后用体积分数70%的食用乙醇分别进行洗脱,洗脱剂流速为1.0mL/min,其余按1.3.5处理。1.3.1纯度和洗脱率对二苯乙烯苷分离的影响以二苯乙烯苷的纯度、洗脱率为考核指标,选取食用乙醇体积分数、洗脱速度、洗脱柱高、吸附时间作为考察因素,进行L9(34)正交试验。同时采用加权综合评分法来考察纯度和洗脱率对二苯乙烯苷分离的综合影响。综合评分=洗脱率×0.4+纯度×0.6.2结果与分析2.1加食用乙醇体积分数食用乙醇体积分数对二苯乙烯苷纯度的影响见图1。图1表明,在食用乙醇体积分数低于70%时,二苯乙烯苷的纯度与洗脱溶剂浓度呈正相关关系,此后,再增加食用乙醇体积分数,二苯乙烯苷的纯度开始下降。根据溶剂作用模式理论,随着食用乙醇体积分数的增加,其在聚酰胺吸附剂表面形成的双吸附层趋势增加,随后二苯乙烯苷分子与吸附剂表面的食用乙醇分子发生缔合作用,之后,食用乙醇带着二苯乙烯苷分子扩散到聚酰胺表面吸附中心,发生吸附、解吸连续循环过程,最终将二苯乙烯苷同其他成分分开。当食用乙醇体积分数为70%时,这种缔合作用最佳;当食用乙醇体积分数继续增加时,这种缔合作用趋势减弱,导致分离效果下降。2.2吸附时间对二苯乙烯苷纯度的影响静置吸附时间对二苯乙烯苷纯度的影响见图2。图2表明,静置吸附时间对二苯乙烯苷纯度具有一定的影响,吸附时间从5min延长到30min时,二苯乙烯苷的纯度从2.82%上升到3.75%;当吸附时间再继续延长时,二苯乙烯苷的纯度不再增加,反而呈下降趋势,而当吸附时间为50min时的纯度最低,为2.74%。这可能是因为吸附时间过短,吸附不完全;而吸附时间过长,解吸困难等因素所致。为了尽量提高洗脱纯度,缩短操作时间,选取30min为最佳静置吸附时间。2.3食用乙醇流速对二苯乙烯苷纯度的影响食用乙醇流速对二苯乙烯苷纯度的影响见图3。图3表明,随着食用乙醇流速的增加,二苯乙烯苷的纯度逐渐下降。这可能是由于洗脱流速对食用乙醇与吸附在聚酰胺上的二苯乙烯苷间的交换速率进行影响所致。当食用乙醇流速为0.5mL/min时,二苯乙烯苷的纯度最高为4.10%;当流速增至2.5mL/min,纯度将为2.38%。这可能是因为流速过快,食用乙醇未能充分与二苯乙烯苷发生缔合作用,导致对二苯乙烯苷分离纯化的作用下降。考虑到流速过低而大大延长洗脱操作时间,因此选择1.0mL/min为较佳的洗脱流速。2.4塔板分离效果洗脱柱高对二苯乙烯苷纯度的影响见图4。图4表明,随着洗脱柱高的增加,柱效越好,二苯乙烯苷的纯度逐渐上升。根据色谱分离过程的塔板理论,柱的分离效果可用理论塔板数表示,若柱长越长,则理论塔板数值越大,表示达成固液平衡的次数越多,分离发生的机会也越多,柱效越好。图4还显示,当柱高增为60cm时,纯度上升幅度明显减缓,鉴于实验室分离用层析柱总长度为80cm,同时考虑到伴随柱高的增加,洗脱时间也相应延长,综合考虑,选用60cm柱高为较佳分离柱高。2.5样品的洗脱工艺条件优化柱层析分离正交试验结果见表1,正交试验的方差分析见表2。表1极差分析表明,对二苯乙烯苷分离效果影响的各因素主次顺序为:食用乙醇体积分数>食用乙醇流速>洗脱柱高>吸附时间。表2方差分析表明,食用乙醇体积分数显著地影响二苯乙烯苷分离的效果,食用乙醇洗脱速度和洗脱柱高为较显著因素,而在本试验研究的范围内,静置吸附时间对二苯乙烯苷的分离影响不显著。表1的K值分析表明,二苯乙烯苷分离的优选工艺条件为A3B2C3D1,但从直观分析可知,二苯乙烯苷分离的优选提取工艺条件为A2B2C3D1。为了确定较佳的分离工艺条件,本研究通过验证性试验从这两种工艺条件中优选一个较好的分离条件。分离工艺条件A3B2C3D1和A2B2C3D1的结果比较见表3。从表3中可以看出,A2B2C3D1的洗脱率和纯度高于A3B2C3D1的。考虑到食用乙醇体积分数是显著因素,同时为提高生产效率和节约能源,最终确定较佳的分离工艺条件为A2B2C3D1,即体积分数70%的乙醇溶液,以1.0mL/min的流速进行洗脱,洗脱柱高为70cm,静置吸附时间为20min。3模型结果分析(1)二苯乙烯苷的较佳分离工艺条件为:食用乙醇体积分数为70%,食用乙醇洗脱流速为1.0mL/min,洗脱柱高为70cm,静置吸附时间为20min。(2)对分离效果影响的各因素主次顺序依次为:食用乙醇体积分数>食用乙醇流速>洗脱柱高>静置吸附时间。通过方差分析检验可知,食用乙醇体积分数