毛泡桐叶中乌索酸的提取分离及反相高效液相色谱分析

毛泡桐叶中乌索酸的提取分离及反相高效液相色谱分析【摘要】目的提取鉴定毛泡桐叶中的乌索酸，并建立其含量测定方法。方法采用“醇提凝析法”新工艺分离制备乌索酸，IR，MS，NMR鉴定其结构。建立反相高效液相色谱测定其含量的方法，色谱柱为KromasilC18柱，流动相为乙腈-甲醇-水-磷酸，流速ml/min，检测波长210nm，柱温25℃。结果乌索酸在～μg范围内线性关系良好。样品乌索酸含量为%，得率为%。结论“醇提凝析法”分离制备乌索酸工艺先进，实用可行，为工业试验生产乌索酸提供了技术条件；RP-HPLC法测定乌索酸含量准确、精密度高、重复性好、线性范围宽，可作为控制乌索酸质量的方法。

【关键词】毛泡桐叶乌索酸结构表征反相高效液相色谱

Abstract：Objective：ToextractandidentifyursolicacidfromPaulowniatomentosa(Thunb.)Steudleavesandtoestablishadeterminationmethodofursolicacid.Methods：UrsolicacidwasextractedfromPaulowniatomentosa(Thunb.)Steudleavesbyadoptinganewmethodofethanolextractionandagglutinationseparation,anditsstructurewasidentifiedbyIR,MSandNMR.AdeterminationmethodofursolicacidinPaulowniatomentosa(Thunb.)Steudleavesbyreversed-phasehighperformanceliquidchromtographwasestablished.Thechromatographiccolumn(KromasilC18,mm×250mm,5μm),acetonitrile-methanol-water-phosphoricacidmobilephase(168:682:150:,V/V)withml/minflowrate,thedetectedwavelength(210nm)andthecolumntemperature(25℃)wereadopted.Results：Ursolicacidshowedgoodlinearrelationshipintherangeof～μg(r=6).Theaveragerecoveryratewas%(RSDwas%).Thecontentwas%andthegainratewas‰.Conclusion：Themethodofethanolextractionandagglutinationseparationtoextractursolicacidisadvanced,rational,practicalandfeasible,anditprovidestechnologyconditionforindustrialproductionofursolicacid.RP-HPLCissimpleandaccurate,ithasgoodrepeatabilityandwiderlinearrange,anditcanbeusedtoevaluatethequalityofursolicacid.

Keywords：Paulowniatomentosa(Thunb.)Steudleaf;Ursolicacid;Structuralcharacteristics;RP-HPLC

毛泡桐叶为玄参科泡桐属植物毛泡桐Paulowniatomentosa(Thunb.)Steud的叶子［1］。泡桐的药用价值我国古代就有记载，《本草纲目》记有“桐叶主恶蚀疮着阴皮主五痔、杀三虫，花主傅猪疮，消肿、生发。”泡桐的花、叶、果、木、皮、根均可入药［2］。泡桐叶含桃叶珊瑚苷、泡桐苷、毛蕊花苷、异毛蕊花苷、糖苷、多酚类［2］及熊果酸、乙酰熊果酸α,β［3］等，其中三萜酸类，特别是乌索酸和齐墩果酸，具有抗菌、抗肝炎、抗肿瘤、降血糖血脂、增强免疫功能等多种药理作用，已引起人们广泛的关注［5，6］。为此，我们以毛泡桐叶为原料，采用“醇提凝析法”提取分离乌索酸［5，6］，并建立RP-HPLC测定分析乌索酸含量的方法，为开发利用丰富的毛泡桐药用植物资源提供科学依据。

1器材与方法1材料

毛泡桐叶采自江西宜春市宜春学院北校区，经江西省天然药物活性成分研究重点实验室鉴定为紫花毛泡桐(Thunb)Steud的叶子。95%乙醇；“YCXY-1号”除杂剂；复合酶制剂；活性炭；甲醇；水为超纯水；乌索酸对照品。2仪器Waters系列高效液相色谱仪；Perkin-Elmer傅立叶变换红外光谱仪(美国)；Autospec-UltimaETOFEL型质谱仪(美国)；INOVA-600型、BruckerACF-400型核磁共振仪(美国)；Boetius显微熔点测定仪(北京)；WZZ-1S数字式自动旋光仪(上海)；RO-MB-10D高纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂)，CP225D电子分析天平(德国Sartourius公司)，FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，202-26A型数显电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)。3乌索酸的提取分离工艺流程见图1。操作步骤采用“醇提凝析法”提取分离。将干燥后的毛泡桐叶10kg粉碎成粗粉，用温水湿润，加入原料干重1%的复合酶制剂，38℃酶解处理24h，滤干，加入8倍重量90%乙醇，85℃回流提取2次，1h/次，合并提取液，过滤，减压回收乙醇得浸膏，以纯水沉降洗涤后加“YCXY-1号”除杂剂除杂处理2次，过滤，用95%乙醇溶解，调pH值碱化，加活性炭脱色，过滤除杂，再用95%乙醇溶解，调pH值酸化，凝析分离、纯化精制，80℃干燥24h，得无色针状结晶，得率为‰。

2结果

样品结构鉴定样品IRKBrmaxυcm-1：3434(-OH)、2968、2927、2871、1694、1456、1384、1031；EI-MS(m/z)：456(M+)、441、438、423、411、410；D、E环离子a：248(a-100)、203(a-COOH)、189(a-CH2-COOH)、133；A、B环离子b：208(b)、207(b-H)、190(b-H2O)和189；1H-NMR(DMSO-d6)示5个季碳甲基：；2个叔碳甲基(δ，J=;，J=，各3H，d)；C18(δ，J=，d)；C3α-H(δ，J=，，，1H，td，)；C12-H(δ，J=，1H，t)；C15-H(δ，J=，1H，brd)；C16-H(δ，J=，，1H，td)；C29-H(δ，J=，3H，d)；C30-H(δ，J=6Hz，3H，d)；13C-NMR(DMSO-d6)示7个伯碳：δ(C23)、(C24)、(C25)、(C26)、(C27)、(C29)、(C30)；9个仲碳：δ(C1)、(C2)、(C6)、(C7)、(C11)、(C15)、(C16)、(C21)、(C22)；7个叔碳：δ(C3)、(C5)、(C9)、(C12)、(C18)、(C19)、(C20)；6个季碳：δ(C4)、(C8)、(C10)、(C13)、(C14)、(C17)；1个羧基碳：(C28)。

以上光谱数据与文献值一致［7，8］，根据光谱数据确证样品为乌索酸。

乌索酸样品含量测定

对照品溶液配制精密称定乌索酸对照品mg，置于10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

样品溶液配制精密称定乌索酸样品mg，置于10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。

检测波长的选择

取乌索酸对照品和样品溶液进样，在190～500nm波长范围进行光谱扫描，乌索酸在流动相中的最大紫外吸收波长均为nm(见图2)，但由于流动相在短波长处有末端吸收，为了消除背景，提高信噪比，提取不同波长的色谱图进行比较，选择210nm为检测波长信噪比高，峰形好，干扰小，最大限度地保证分析结果的准确。

色谱条件色谱柱为KromasilC18柱；流动相为乙腈-甲醇-水-磷酸；流速ml·min-1；检测波长210nm；柱温为25℃。以乌索酸计，理论塔板数分别为16675，分离度为，对称因子分别为，外标法定量分析。

线性关系实验用微量注射器精密吸取乌索酸对照品溶液1，2，6，10，14，18μl进样分析，平行3次，按色谱条件测定峰面积，以对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得乌索酸回归方程为：Y=×105X+×104。表明当乌索酸进样量在～μg之间时，线性关系良好。

精密度实验精密吸取乌索酸对照品溶液10μl进样，重复5次，测得乌索酸峰面积RSD为%(n=5)，本方法精密度良好。

重复性实验精密称取同一批乌索酸样品5份，配制样品溶液，吸取10μl进样分析，测得乌索酸峰面积RSD为%(n=5)，本方法重复性好。

乌索酸含量测定吸取样品溶液10μl进样分析，重复进样5次，样品中乌索酸的含量为%。

3讨论

泡桐是玄参科落叶乔木，原产于我国，现有9个种，4个变种［1］，国内分布广泛，资源丰富。毛泡桐叶中不仅乌索酸含量较高，而且其同分异构体齐墩果酸含量极低，经研究测定其叶中乌索酸含量高达‰［9，10］，为乌索酸的开发开辟了新的原料路线。

采用“醇提凝析法”新工艺，从毛泡桐中提取分离乌索酸，仅以乙醇为溶剂，未加其它有机溶剂，采用自制的“YCXY-1号”除杂剂，有效去除脂类、类脂类、酚类及叶绿素等杂质，不仅提高了产品的安全性，而且简化了工艺流程，降低了生产成本，有利于乌索酸的富集和纯化，其含量达%，得率达%，具有制备量大，质量稳定，易于实现工业化生产等特点。

本研究选用乙腈-甲醇-水体系为流动相，发现当流动相洗脱速度达ml·min-1时，乌索酸与其同分异构体齐墩果酸达到了基线分离，但峰形拖尾，这是由于结构中的羧基存在解离现象，加入适量磷酸能有效抑制其解离，使拖尾现象得以改善，峰形尖锐对称。经多次预实验选定流动相为乙腈-甲醇-水-磷酸，流速为ml·min-1。

乌索酸在流动相中的紫外吸收光谱显示其最大吸收波

长为nm，但溶剂甲醇在短波长处亦有吸收，为减少干扰，且不至于降低检测的灵敏度，故确定210nm为检测波长。

采用该实验建立的RP-HPLC法测定毛泡桐中乌索酸的含量，样品处理简单，无其它杂质的干扰，方法简便、快速，分离效果好，数据准确可靠，为相关植物中乌索酸含量的测定提供了科学的分析手段。

致谢：乌索酸的质谱、核磁共振谱由中国海洋大学药物研究所李英霞教授代测。

【参考文献】

［1］中国科学院泡桐调查组.泡桐研究［M］.北京:中国农业出版社,1980.

［2］潘晓辉,田涛.毛泡桐花挥发油的提取［J］.安康师专学报,2003,15(4):69.

［3］韩晶,孙来九.从毛泡桐叶中提取、分离熊果酸的新工艺研究［J］.西北大学学报(自然科学版),2003,33(3):304.

［4］LIUofoleanolicacidandursolicacid［J］.JournalofEthnopharmacology,1995,45:57.

［5］李开泉,陈武,熊筱娟,等.乌索酸的化学研究概况［J］.宜春医专学报,2001,13(2);128.

［6］陈武,李开泉,熊筱娟,等.陆