超敏反应性疾病医疗管理知识学检测课件

第七单元超敏反应性疾病的免疫学检测第七单元1实验一血清的检测实验一血清的检测2一、血清总的检测实验目的1.掌握双抗体夹心法测定血清总的方法。2.熟悉在I型超敏反应中的作用和临床意义。一、血清总的检测实验目的3EEEE洗涤待测抗原包被抗体酶标抗体实验原理双抗体夹心法EEEE洗涤待测抗原包被抗体酶标抗体实验原理双4实验材料1.羊抗人抗体、标记的羊抗人抗体、校准品、（四甲基联苯胺）。2.标本：待测血清。3.包被缓冲液、洗涤缓冲液、反应终止液（2H24）等。4.酶标板、微量加样器、酶标仪、温箱等。实验材料51.包被羊抗人抗体（4℃过夜，洗涤）2.封闭（0.5%的小牛血清或牛血清清蛋白）3.加样（梯度稀释的校准品、待测血清、阳性对照、阴性对照、空白对照）4.37℃温育2h，洗涤5.加入工作浓度的标记的羊抗人6.37℃温育2h，洗涤EEEE操作步骤1.包被羊抗人抗体（4℃过夜，洗涤）2.封闭（0.5%的68.加入终止液，终止反应9.492波长测各孔吸光度值（A值）7.加入底物，37℃温育15分钟8.加入终止液，终止反应9.492波长测各孔吸光度值（A值7注意事项1.包被抗体量、酶标抗体的加入量等可影响测定结果，需预先摸索最佳条件。2.洗涤要彻底，必要时可加大洗涤液的浓度。3.结果判断须在10分钟内完成。4含量与吸光度值在一定范围内呈线性关系，如果样品的测定结果超出此范围，应对样品进行适当的稀释，使样品中的浓度在线性范围内再行测定。注意事项8结果分析以校准品的参考含量（）为横坐标，以对应A值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待测样品的A值，在标准曲线中查出稀释后样品中的浓度，再乘以稀释倍数，即为原样品中的浓度。12.4。结果分析9临床意义血清总水平一般用国际单位（）或表示，1＝2.4，相当于标准冻干血清制剂0.00928内所含的量。正常人群水平受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响，以致各家报道的正常值相差甚远。婴儿脐带血水平小于0.5，出生后随年龄增长而逐渐升高，12岁时达成人水平。成人血清水平约在20～200之间，一般认为大于333（800）时为异常升高。升高相关的常见疾病有：过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、麻风、类天疱疮及某些寄生虫感染等。上述疾病时升高的程度并不一致，在过敏性支气管肺曲菌病时最为显著，其值可达5000～20000，除了此病和特应性皮炎以及在花粉季节之外，任何血清总水平大于5000的患者均应考虑寄生虫感染的可能性。临床意义10思考题1.双抗体夹心法定量测定血清总的原理及应注意的问题有哪些？2.测定血清总的临床意义？思考题11二、血清特异性的检测实验目的1.掌握斑点酶免疫印迹法检测的原理和方法。2.熟悉在I型超敏反应中的作用和临床意义。二、血清特异性的检测实验目的12实验原理斑点酶免疫印迹法：用膜作为固相支持物，检测区的不同区域包被有特异性的过敏原，质控区包被有兔抗鼠抗体。检测时将稀释的病人血清加入反应槽内，血清中的与膜上的相应过敏原结合。通过洗涤去掉未结合的游离物质，再加入酶标记的抗人抗体，此抗体会与检测区膜上的结合，同时会与质控区上的兔抗鼠抗体结合。如标本中无，酶标抗体不能结合在检测区相应过敏原区带上。通过洗涤去掉未结合的标记物，然后加入底物显色。通过显色区带确定血清中含有哪种，进而判断待检者对哪种过敏原过敏。实验原理斑点酶免疫印迹法：用膜作为固相支持13超敏反应性疾病医疗管理知识学检测课件14实验材料1.检测条包被有特异性过敏原的膜2.碱性磷酸酶标记的抗人3.标本稀释液4.碱性磷酸酶底物5.浓缩洗液（10X）洗液按照1:10倍稀释6.标本待测血清用标本稀释液按照1:10倍稀释。实验材料15稀释好的洗液将检测条要充分浸透，放在摇床上摇10分钟倒掉洗液，加入稀释好的测试者血清，放于摇床室温反应1.5小时倒掉小槽中的血清，依次加入洗液，震荡10分钟，重复三次每槽加入碱性磷酸酶标记的抗人，放于摇床上室温反应30分钟将碱性磷酸酶标记的抗人倒掉，用洗液洗三次，每次10分钟加入碱性磷酸酶底物，放于摇床，避光反应约10分钟去掉底物溶液，用纯水洗三次，每次5分钟操作步骤将检测条放在干燥纸上，等检测条完全干燥后判定检测结果稀释好的洗液将检测条要充分浸透，放在摇床上摇10分钟倒掉洗液16注意事项1.不同批次的组分不可混用，且只能在效期内使用。2.检测标本只限于人血清、血浆。3.如果样本在3天内检测，可以保存在2~8℃，否则应冷冻保存，避免反复冻溶。4.如果标本含有不溶物，离心去除。溶血、浑浊或含有叠氮钠的标本不可用。5.加样器枪头不可混用，避免交叉污染。注意事项17结果分析通过显色区带确定血清中含有哪种，进而判断待检者对哪种过敏原过敏。临床意义测定是体外检测变应原的重要手段，主要用于Ⅰ型超敏反应的诊断。该检测条包被有多种特异性过敏原，通过检测血浆（血清）中过敏原，筛查待检者对何种过敏原过敏，为临床进行脱敏治疗奠定基础。结果分析通过显色区带确定血清中含有哪种，进而18小结和讨论1.人类I型超敏反应可表现为全身性超敏反应和局部性超敏反应两种。2.在5类免疫球蛋白中，是血清中含量最低，半衰期最短，分解率最高，对热最不稳定的。而在I型超敏反应患者体内，含量显著增高。3.血清总的含量是由各种抗原的总和决定。正常人血清含量极微，约0.1～0.9水平。临床上一般采用敏感性较高、稳定性较好的化学发光免疫测定法、酶联免疫测定法进行检测。小结和讨论1.人类I型超敏反应可表现为全身性超敏反应和局部性19思考题1.测定血清的方法有哪些？各有何优缺点？2.测定血清的临床意义？思考题20实验二红细胞表面不完全抗体的检测实验二红细胞表面不完全抗体的检测21一、直接试验（试管法）实验目的1.掌握直接试验的原理和操作方法。2.熟悉试验的临床意义。一、直接试验（试管法）实验目的22＋患者红细胞试剂检测红细胞上不完全抗体实验原理＋患者红细胞试剂检测红细胞上不完全抗体实验原理23实验材料1.诊断试剂抗球蛋白试剂；2.待测患者红细胞；3.生理盐水、小试管、吸管、离心机等。实验材料24操作步骤用生理盐水配5%红细胞悬液取洁净小试管2支，1管加1滴5%红细胞悬液，另一管加生理盐水作对照在生理盐水和5%红细胞悬液中分别加入诊断试剂一滴，使其混匀，室温稍待片刻1000r离心1或3000r离心15s。取出试管先以肉眼观察有无溶血，再轻轻摇动试管，如有凝集，则为阳性结果；如无凝集，应在室温延长15~30的反应时间，再离心看结果。操作步骤25注意事项1.每次试验均须设阴、阳性对照，如阴性对照发生自凝，实验无效。2.受检血标本必须新鲜。3.洗涤后的红细胞和器材都不能残留有血浆蛋白，以免出现假阴性。4.操作过程中动作轻柔，特别是观察反应结果时，应轻轻摇动试管，不可用力过大。5.判定结果时，溶血与凝集有同样意义。6.试验后应将玻片即时放入消毒缸内。注意事项26结果分析生理盐水对照不应发生凝集，为均匀浑浊的乳状液。在红细胞悬液中，如红细胞凝集成片状，边缘皱褶如花边状或边缘松散为阳性。如与对照相同，为阴性。结果分析27临床意义直接试验用于检测患者红细胞上不完全抗体，试验阳性可见于自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、药物诱发的免疫性溶血性贫血、新生儿同种免疫性溶血病、某些高球蛋白血症患者，如系统性红斑狼疮、类风湿、恶性肿瘤等。思考题直接试验的原理及临床意义？临床意义思考题28二、间接试验（微柱凝胶法）实验目的1.掌握间接试验的原理和操作方法。2.熟悉试验的临床意义。二、间接试验（微柱凝胶法）实验目的29患者血清靶红细胞致敏红细胞试剂检测血清中的抗红细胞抗体实验原理患者血清靶红细胞致敏红细胞试剂检测血清中的抗红细胞抗体实验原30实验材料1.微柱凝胶卡内含抗球蛋白试剂；2.筛选红细胞一般由2~3人份O型红细胞组成一套试剂3.待测患者血清；4.生理盐水、小试管、吸管、试管架、离心机、温箱等。实验材料31操作步骤撕开微柱凝胶卡密封纸，标记加1%筛选红细胞50μl及受检者血清25μl37℃孵育15离心机离心10，1000观察结果，如红细胞悬浮在反应管顶部或凝胶中，则为阳性结果；反之，如红细胞沉于凝胶底部（管底尖部），则为阴性结果。操作步骤撕开微柱凝胶卡密封纸，标记32注意事项1.反应卡封口有损坏，管中干涸或有气泡时，不可使用。使用前必须清楚标记试剂卡,一定要空离心一次后备用。2.不要将试剂卡长期保存4℃，在此温度下，试剂卡中液体蒸发凝集于封口铝箔下，胶易干涸，应将试剂卡保存在18~22℃。3.细胞浓度为0.81%，浓度过高或过低，均可减弱凝集强度。4.纤维蛋白可吸附部分红细胞，导致假阳性结果。5.细菌污染、不适宜储存或过期都能使试剂失效。6.须设阴、阳性对照。7.微柱凝胶管中出现溶血现象，特别提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其它原因所致溶血，对此标本一定要认真分析。注意事项33结果分析-100%的红细胞沉在微管的底部100%的红细胞沉在微管的下端1/3之内1+80%的红细胞沉在微管的下端2/3之内2+80%的红细胞沉在微管的上端2/3之内3+80%的红细胞沉在微管的上端1/3之内4+凝集的细胞全部处于微管的顶部.双群.溶血反应格局及判断标准结果分析-100%的红细胞沉在微管的底部反应格34临床意义间接试验用于检测患者游离血清中的不完全抗体。此实验多用于检测母体（D）抗体，以便及早发现和避免新生儿溶血症的发生，亦可对红细胞不相容的输血所产生的血型抗体进行检测。临床意义35小结和讨论1.检测抗红细胞不完全抗体的常用方法为抗球蛋白试验，又称为试验，直接试验用于检测患者红细胞上不完全抗体；间接试验用于检测患者游离血清中的不完全抗体。2试验阳性可见于自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、药物诱发的免疫性溶血性贫血、新生儿同种免疫性溶血病、某些高球蛋白血症患者，如系统性红斑狼疮、类风湿、恶性肿瘤等。小结和讨论1.检测抗红细胞不完全抗体的常用方法为抗球蛋白试验36思考题1.新生儿溶血症发生的机制是什么？2.微柱凝胶免疫试验可能出现的结果有哪些，试分析原因？思考题37实验三循环免疫复合物的检测实验三循环免疫复合物的检测38实验目的1.掌握比浊法检测循环免疫复合物的原理和方法。2.熟悉循环免疫复合物检测的临床意义。实验目的39实验原理本试验是检测抗原非特异性循环免疫复合物的一种方法。是环氧乙烷和水的多聚物，为一种不带电荷的直链大分子多糖。终浓度为3%～4%的能相对选择性地沉淀。用分光光度计测定浊度，反应沉淀物含量。实验原理40实验材料18.40.1硼酸盐缓冲液（）硼砂4.29g、硼酸3.40g，蒸馏水加至1000，溶解后用G3或G4号玻璃滤器过滤；2稀释液600040.0g、10.0g、加至1000，溶解后用G3或G4号玻璃滤器过滤；3.待检血清、微量加样器、试管、吸管及橡皮滴头等；4.分光光度计。实验材料41加入物测试管对照管（）—2.0稀释液（）2.0—待检血清（）0.20.237℃水浴60分光光度计测A495值操作步骤加入物测试管对照管（）—2.0稀释液（）2.0—待42注意事项1.4能沉淀较小的，2只能沉淀较大的，但浓度大于5%，选择性沉淀的特性即行消失，导致假阳性的出现。2.应注意实验温度变化对结果的影响，离心速度与时间也应严格掌握。3.低密度脂蛋白可引起浊度增加，故应空腹采血。4.高γ球蛋白血症以及血清标本反复冻融，均易造成假阳性。注意事项43结果分析待检血清浊度值=（测定管吸光度-对照管吸光度）×100，以大于正常人浊度值均值加2个标准差为阳性。参考值：正常人血清的A值为4.3±2.0，以≥8.3为免疫复合物阳性。结果分析44临床意义循环免疫复合物（，）又称可溶性免疫复合物，分子量为50万～100万，沉降系数8.8～19S，它不易被吞噬细胞吞噬，又不能经肾小球排出，可较长时间在血液中循环，一旦大量循环免疫复合物沉积于组织中，则引起组织损伤及相关的免疫复合物病。阳性常见于：1.部分自身免疫性疾病，如，类风湿关节炎等；2.膜增殖性肾炎，链球菌感染后肾炎；3.传染病，如慢性乙型肝炎，疟疾，麻风等；4.恶性肿瘤。临床意义45小结和讨论1.循环免疫复合物的检测有助于辅助诊断某些免疫复合物疾病，如血清病、、慢性活动性肝炎时，往往较高；此外，对的动态检测有助于监视某些疾病的发展，协助判断疗效和预后；有助于探讨研究型变态反应疾病的发病机制。2.此法快速简便，但特异性较差，仅适于筛选。检测方法较多，原理各不相同，结果也不尽一样，因此最好采用多种方法同时进行，以提高阳性检出率。由于在病理状态下往往是单一种类抗原抗体复合物增高，这种增高只有达到影响总水平才能被检出，所以有时检测抗原特异性更为重要。小结和讨论1.循环免疫复合物的检测有助于辅助诊断某些免疫复合46思考题循环免疫复合物检测的临床意义？思考题47病案讨论超敏反应性疾病病案讨论超敏反应性疾病48实验目的通过病案讨论、提出问题、应用免疫学技术检测有关免疫学指标，将免疫学技术应用于临床实践，对临床疾病做出诊断或医疗建议，进而对有关问题产生深入研究的学习动机。实验目的49病案讨论一患者王X，女28岁。因上呼吸道感染前来我院就诊。按医嘱作青霉素皮试阴性，给静滴青霉素800万U加5250。患者上午9点左右开始输液，约1点40分左右输液毕，无任何不适反应，下午3点左右患者感觉全身不适，似有好多虫子、蚂蚁在身上爬，全身紧困，随即出现心慌等不适前来复诊。一般尚可，痛苦面容，测100/70、P128次/分、心电监护提示频繁室早、R30次/分、明显缺氧症。遵医嘱给肌注肾上腺素1，5250，地塞米松10静滴；第二组10250，利多卡因100，给氧等处理后症状仍无明显改善转入入院治疗，入院后给抗过敏、抗心律失常治疗，一周后病人自觉症状消失，痊愈出院。

问题：1.该患者有可能属于哪型超敏反应？2.如何进行免疫学诊断？病案讨论一50病案讨论二第一胎足月儿，顺产无窒息，体重3200克，生后母乳喂养。第2天出现黄疸，第3天加重，测总胆红素18，患儿精神较差，有贫血貌。体查：除黄疸外，无其他阳性体征。母亲为阴性血型，胎儿为阳性血型。问题：1.如何进行诊断和鉴别诊断？2.还须做哪些实验室检查？病案讨论二51病案讨论三患者何X，女，19岁，自3年前有间断关节疼痛，曾服用解热止痛的西药无明显好转，半年前出现面部红斑，发热，关节疼痛加重，诊断为“系统性红斑狼疮”，应用强的松及环磷酰胺等药物治疗，半年来面部红斑时轻时重，就诊时口服强的松每日15，面部蝶形红斑呈暗红色，双手红斑色鲜，自觉发热，五心烦热，体温正常，口干咽燥，失眠盗汗，口腔溃疡，脱发，疲乏，多关节疼痛，下肢皮下见数个紫斑，刷牙时偶有牙龈出血，腰部有酸痛感，饮食及二便正常，月经量少，色淡，舌淡红，苔薄黄，脉弦细，心肺无明显阳性体征。初步判断为型超敏反应。化验血红蛋白103，血白细胞5.0×109，血小板60×109，尿蛋白，24小时尿蛋白定量3.0g，尿中红细胞+，血沉34，肝肾功能正常，抗核抗体阳性，滴度为1:160，抗抗体阳性，血免疫球蛋白系在正常范围，补体C3稍低于正常。问题：试分析还须做哪些实验室检查以进一步明确诊断？病案讨论三52病案讨论四女性，59岁，间断咳嗽、咳痰5年，加重伴咯血2个月。患者5年前受凉后低热、咳嗽、咳白色粘痰，给予抗生素及祛痰治疗，1个月后症状不见好转，体重逐渐下降，后拍胸片诊为“浸润型肺结核”，肌注链霉素1个月，口服利福平、雷米封3个月，症状逐渐减轻，遂自行停药，此后一直咳嗽，少量白痰，未再复查胸片。2个月前劳累后咳嗽加重，少量咯血伴低热、盗汗、胸闷、乏力又来诊。体查：两上肺呼吸音稍减低，并闻及少量湿罗音，心叩不大，心率94次/分，律齐，无杂音。结核菌素皮试阳性。问题：1、该患者属于哪一型超敏反应？2、还须做哪些实验室检查？病案讨论四53病案讨论提示病案讨论一：1.该患者属于I型超敏反应。2.免疫学诊断分为体内检测（如皮肤试验）和体外测定，详见实验一和临床见习。病案讨论提示病案讨论一：54病案讨论二：1.诊断和鉴别诊断（1）生理性黄疸：生后2~3d出现，4~5d达到高峰，总胆红素值12.9，7~10d消退。本例特点：总胆红素18，超过峰值。（2）感染性黄疸：先天感染：查血“”后天感染：有没有感染病灶本例无症状、无感染病灶、母亲无感染史，可排除感染性黄疸。因胎儿总胆红素18，精神较差，有贫血貌，母亲为阴性血型，胎儿为阳性血型。是否为血型不合引起的新生儿溶血？2.实验室检查（1）血常规（2）抗体检测（3）直接试验和间接试验（须检测母亲血清中抗体效价）病案讨论二：55病案讨论三：实验室检查：1.血常规2.尿常规3.肝、肾功能、腹部B超4谱及其他免疫抗体检查5.血清免疫球蛋白，补体C3、C4检查6.循环免疫复合物检测并结合局部免疫复合物的免疫组化检测结果以明确病变是否与型超敏反应有关。病案讨论三：56病案讨论四：该患者属于型超敏反应。实验室检查：1线胸片2.化学发光法测结核分枝杆菌3.痰找结核菌，必要时经纤维支气管镜取分泌物找结核菌，支气管内膜活检，血清结核抗体检测。4.化验：血常规、、尿常规病案讨论四：57临床见习临床常用超敏反应性疾病免疫学检测项目与临床应用

临床见习临床常用超敏反应性疾病58实验目的掌握各型超敏反应常用的免疫学检测项目及临床应用实验目的59一、I型超敏反应免疫学检测项目及临床应用1型超敏反应常见的免疫学检测项目一、I型超敏反应免疫学检测项目及临床应用1型超敏反应常见的免602.临床应用（1）寻找变应原：（2）预防药物或疫苗过敏：（3）评价宿主细胞免疫状态：（4）传染病的诊断：2.临床应用（1）寻找变应原：61