原虫检验技术2010培训(陕西)

疟原虫检验技术中国CDC寄生虫病所疟疾室郑香

疟原虫检验技术●采集血样●血片的制作与染色●原虫镜检

1.白细胞原虫密度计数法2.原虫形态鉴定采集血样采血部位：耳垂或无名指，取血方法：通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小,薄血膜血量为厚血膜的一半或1/3。厚血膜用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适当远的地方.将推片的边缘紧贴载玻片，轻轻上下移动，使血液沿边缘散开，然后匀速地向前推进，形成薄而平铺的薄血膜血片制作厚血膜薄血膜标准的疟疾厚薄血膜片标签●厚血膜血量不宜过多或过少●薄血膜平整,无皱折和空泡.显微镜下红细胞单层排列各种不同的疟疾血片涂制法：标准血片门诊发热病人血片居民普查血片血片染色

两种染色方法:●吉氏染色法●瑞氏染色法

WHO推荐使用吉氏染色法吉氏染液(原液)的配置

吉氏染粉(AzureBtype)5g甘油(纯)250ml甲醇

(纯)250ml●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨,

然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存时间越长染色效果越好。●整个染色液配制时间不能少于5个小时稀释吉氏原液●原液需经缓冲液（PH7.0）或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。

●吸取原液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果.血片染色用甲醇固定薄血膜，待厚血膜充分干燥（要点：甲醇不能触碰到厚血膜）操作1（快染）

量筒内量2ml缓冲液(PBSPH7.0)或净水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水缓缓冲洗，晾干（血膜朝内面）镜检。操作2(慢染)在量筒内量2ml缓冲液或净水，再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色30min。清水缓缓冲洗，晾干镜检。血片染色将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30分钟。（如染液稀释液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将染色片插于晾干板上晾干，包装，待镜检。成批血片染色厚血膜溶血染色放置多时未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固定），在染色之前，须在厚血膜上用清水进行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液染色30分钟。然后用清水漂洗干净,晾干。质量好的染色

显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色，薄血膜平整，红细胞单层排列

如果血片偏红,说明染液偏酸性如果血片偏蓝,说明染液偏硷性外观吉氏染色血片偏酸偏碱标准血片制作与染色注意事项

●

载玻片必须清洁无油污●

固定薄血膜时，甲醇不要触碰到厚血膜●

放置3天以上的血片，在染色之前先用清水滴加在厚血膜上进行溶血，以防厚血膜染色后颜色发黑，影响镜检.●血片充分干燥后方可染色，防止冲洗染液时厚血膜脱落.疟原虫镜检疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点

厚血膜

薄血膜

优点血量多，面积小，一个厚血膜的血量相当于20张薄血片。原虫检出率高经甲醇固定，红细胞完整，原虫形态改变不大，原虫易于辨认缺点原虫在干燥过程中皱缩，红细胞消失，原虫变形较大，原虫鉴定困难血量比厚血膜少许多，但面积是厚血膜的8-10倍。检查费时，原虫检出率较低用途用于疟疾病人检查原虫虫种、虫期鉴定及初学者教学标本疟原虫密度计算计算疟原虫密度的三种方法：●

白细胞原虫密度计数法(厚血膜WHO)

优点：可作为定性和定量分析●半定量计数法(厚血膜)

优点：方法简便

缺点：只能定性，不宜作为定量分析●

红细胞感染密度计算法(薄血膜)白细胞原虫密度计数用途●确定患者原虫感染程度●抗疟后考核原虫密度●课题研究显微镜下厚血膜读片顺序白细胞原虫密度计数操作显微镜里按顺序由上而下、之字形读片×不需要计数的视野●需要进行白细胞、疟原虫计数的视野如果该视野无原虫，则计数白细胞数

■看到第一个原虫开始计数

白细胞原虫密度计数方法●在厚血膜按视野顺序，从看到第一个疟原虫计数开始，记录200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数500~1000个。●白细胞疟原虫计算公式：疟原虫数÷计数的白细胞数×患者每微升血白细胞数=疟原虫数/μl血。●如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8000个白细胞计数(国际标准)。白细胞疟原虫密度计数法白细胞疟原虫计数法举例●假设计数200WBC中有35个疟原虫，在不知患者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细胞计数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为：35（计数的疟原虫数）÷200（计数的白细胞）x8000（每微升血白细胞数）=1400/μl答：该患者的疟原虫密度为1400/μl。用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估算出疟原虫密度。此方法将密度分为6级：1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”3.平均每个视野1~5个虫，记录“＋”4.平均每个视野6~10个虫，记录“++”5.平均每个视野11~100个虫，记录“+++”6.平均每个视野100个虫以上，记录“++++”。

如：PvR+T++G少这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。半定量计数法如何确定疟原虫血片为阴性●检查全部厚血膜视野未查见疟原虫●

最少检查100个厚血膜视野未查见疟原虫（临床病人）人体四种疟原虫的分布疟原虫镜检感染人的疟原虫有四种:

恶性疟原虫P.falciparum

间日疟原虫P.vivax三日疟原虫P.malariae

卵形疟原虫P.ovale

恶性疟P.falciparum

●

分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病●我国流行区域为云南省和海南省●

四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者感染后出现急性症状,不及时治疗可危及生命（脑型疟）间日疟

P.vivax

●

间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中部地区●

病程良性,有复发●

遍布全球温带地区及大片热带地区。在热带非洲，特别是西非则很少见三日疟

P.malariae

●遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那及印度部分地区，呈片状、块状分布●三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在报告卵形疟（蛋形疟）P.ovale●主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东南亚有散在报告●在我国已基本消灭

四种疟原虫形态特征

原虫镜检红细胞不涨大小滋养体（环状体）纤细,常有多重感染，环状体内可有2个核

环状体可贴在红细胞边缘

血片中没有其他发育期的大滋养体配子体呈新月形或腊肠形成熟裂殖体约含16-32个裂殖子可出现茂氏点恶性疟（P.falciparum）鉴定要点红细胞通常涨大薛氏点明显成熟环状体粗大滋养体胞浆有阿米巴样伪足血片中可见各期的原虫形态成熟裂殖体约含12-24个裂殖子

间日疟（P.vivax）鉴定要点红细胞不涨大或略小环状体可呈方形胞浆不活跃呈带状形成熟滋养体呈菊花状,内含6-12个裂殖子

核可能出现在环状体边缘

三日疟（P.malariae）诊断要点卵形疟（P.ovale）诊断要点红细胞正常或略涨大

常见慧星状(也称齿轮状)环粗大薛氏点明显

成熟滋养体类似三日疟原虫但更粗大成熟裂殖体约含6-12个裂殖子

类型周围血中发育阶段红细胞形态疟原虫形态大小点彩胞浆疟色素裂殖子数恶性疟原虫环状体配子体正常大小茂氏点小滋养体纤细，常见２个核，一个红细胞内常有2个以上的原虫粗黑，配子体中明显

16-32间日疟原虫各期滋养体裂殖体配子体涨大,可达正常的1.5-2倍薛氏点阿米巴样滋养体，浅蓝色，活泼金棕色不明显12-24

卵形疟原虫各期均有正常大小或略涨大,

薛氏点卵圆形滋养体，蓝色较深，核较大深棕色明显6-12三日疟原虫各期均有裂殖体正常或略缩小齐氏点（西门氏）但少见圆形，蓝色深，核紧缩，滋养体胞浆呈带状深棕色，粗明显6-12

混合感染●在一个血膜上有2种以上疟原虫感染称为混合感染，较常见的是间日疟原虫与恶性疟原虫混合●镜检判断P.v+P.f混合感染,必须是看到P.v各期原虫和P.f的配子体镜检示教以下血片采自现症病例Thisisathinfilmfroma27yearoldfemalebackpacker,witharecenthistoryoftrekkingthroughNorthernThailandandhighfever.

AtypicalPlasmodiumfalciparumpresentation.●Numerousfineringforms●Doublechromatindots●Marginalforms●RedcellsarenotenlargedAthinfilmfroma22yearoldmaleholidayinginLombok(Indonesia)onemonthpreviously.Intermittentfeverssincereturning.AtypicalPlasmodiumvivaxpresenta