基因操作技术原理

第二章基因操作的主要技术原理第一节核酸的凝胶电泳第二节扩增原理(PCR)第三节分子杂交第四节测序一、原理二、分类:琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳（PFGE）

核酸的凝胶电泳是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。第一节核酸的凝胶电泳

带有负电荷的核苷酸链（DNA或RNA），依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。一、原理

分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；

同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型SeparationRangeVs.%AgarosePolyAcrylamideGels琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间凝胶电泳的分辨力与凝胶的类型和密度相关

琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。二、分类—琼脂糖凝胶电泳低熔点（LMP）琼脂糖的熔点在62～65℃，熔解后，在37℃可保持液态数小时；在25℃可保持液态约10min。可以用来回收DNA分子、直接酶切。

缓冲液：1×TAE（TBETPE）凝胶的含量：根据检测的DNA大小加DNA样品：<1μg，loaddingbuffer(指示剂)电泳条件：大片断低电压长时间;小片段高电压短时间染色和观察：溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。可看到0.05μg的微量DNA；DNA的片断大小与荧光强度成正比

琼脂糖凝胶电泳的参数Agarosegelelectrophoresis溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小。二、分类－琼脂糖凝胶电泳（RNA变性凝胶电泳）RNA由单链核苷酸组成，其局部可形成双链的二级结构或三级结构。因此欲测定RNA较准确的分子大小，必须在变性条件下进行电泳。其他同DNA电泳。RNA变性条件下进行电泳，所使用的变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺。尿素和甲酰胺通常用于RNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，因为它们会影响琼脂糖固化。在琼脂糖凝胶电泳时，用选择就是前三种。用甲醛变性电泳后若需将核酸转移至硝酸纤维素膜上(如Narthern等)核酸需再经NaOH变性，控制不当易断裂RNA，甲醛还有强烈的刺激性气味。羟甲基汞是最理想的变性剂，但毒性大。因此，一般均选用乙二醛作变性剂。1、乙二醛的处理商品乙二醛为40%溶液(6M/L)。乙二醛中含少量的，乙二酸、乙醛酸和甲酸等氧化物。使用前必须经强碱强酸混合型树脂去离子，否则会把RNA降解。反复处理直至溶液pH值大于5.0为止。然后分装小份。2、上样前的变性处理(RNA变性处理)去离子乙二醛2.7μl，二甲基亚砜(DMSO)8.0μl，0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)1.6μl，RNA(1～20μg)3.7μl。混合后在50℃保温1小时。再与4μl上样指示剂混并立即电泳。3、染色染色最好能够用30μg/ml吖啶橙浸胶。尽量少用或不用溴化乙锭，因为乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，改变溴化乙锭的光谱性质。绝对应禁止将溴化乙锭灌注胶内。1.5%琼脂糖分析小于1kb的RNA，1%琼脂糖分析大于1kb的RNA分子。电泳缓冲液应为10mM磷酸钠电泳液。缓冲液：TBE凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（10％）。二、分类—聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺单体

由过硫酸铵提供并可被TEMED(N，N，N′，N′—四甲基乙二胺)所稳定的自由基激发链式反应，使丙烯酰胺聚成长链。双功能基因团，N，N′—亚甲双丙烯酰胺参与聚合反应时，链与链之间均匀交联成凝胶，其孔径由链长和交联度决定。N，N′—亚甲双丙烯酰胺共价交联的聚丙烯酰胺结构如下：共价交联孔径大小由链长和交联度所决定，即丙烯酰胺的浓度。TBE缓冲体系染色-银染（AgNO3）1984年,D.Schwartz&C.Centor发明，DNA分子的螺旋半径超过凝胶分子孔径。二、分类—脉冲电场凝胶电泳（PFGE—pulse-fieldgelelectrophoresis）能够分离超大分子量的DNA分子（107bp）。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。电泳方向与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。PFGEcanresolvelargeDNAfragmentsback一、PCR技术原理二、PCR技术的应用第二节扩增的原理（PCR）基因扩增（geneamplification）

1.体外扩增(PCR)2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增4.程序基因扩增（programmeedgeneamplification）

真核生物特定发育阶段合成高水平基因产物的手段5.进化过程中的基因扩增体内扩增PCR(polymerasechainreaction)技术在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明。PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，又称之为体外扩增法。一、PCR技术原理KaryB.Mullis

Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术

1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。（1）作为模板的DNA序列；（2）引物（20个左右碱基的短DNA单链），与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。需要加入4种物质：变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。PCR反应的温度循环周期TypicalPCRThermalProfile*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompre