原理应用探针设计和应用实例

实时荧光定量PCR原理及应用郝近技术支持fas229上海吉泰生物科技有限公司内容提纲荧光定量PCR原理及应用荧光定量PCR实验引物/探针设计及实验条件优化StratageneMx3000P荧光定量PCR仪常规核酸定量方法Southern杂交Northern杂交原位杂交传统RT-PCR半定量PCR存在的问题

灵敏度准确性特异性时间RealtimePCR定义

利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控目的

对起始模板进行定量

优点

灵敏,重复性,动态范围宽,高通量原理C(t)值与起始模板浓度的对数成比例应用

肿瘤，微生物检测，SNP等荧光化学原理SYBRGreenITMTaqMan®/TaqMan-MGB®MolecularBeaconsMGBEclipseTMProbesLux®primersScorpionsTM

AmplifluorQ-ZymeOthers...染料法：探针法：ssDNA+freedye(weakfluorophore)dsDNA=Bindsminorgroove(intensefluorophore)SYBRGreenIdye

(dsDNA-bindingdye)TaqMan®ProbesUnboundprobefreeinsolutionProbeandprimerbindtarget,FREToccursLightEmissionorHeatDonordye(Reporter)Acceptordye(Quencher)LightEnergytransferTaqTaqextendsandhydrolyzesprobe,donordyefreetoemitfluorescence-->accumulationofsignalTaqLightEmissionLight什么是C(t)值C(t)Threshold（域值）Non-QuantitativeNatureofPCREndpointProductsCtEndpoints30~40个循环后，由于扩增效率下降，产物量差异很大反应初期，即刚刚检测到荧光时，每个反应管中产物量差异很小96replicatesofB7genemolecularbeacon传统的定量方法11,500counts/5200counts=2.2folddifferenceReal-time定量Ct18andCt22,2^(4Ctshift)=16folddifference定量PCR是如何定量的？标准曲线

未知样品的C(t)值

定量荧光定量PCR应用特异核酸（基因）定量RNA(cDNA)基因表达差异分析基因芯片结果验证DNA病原体定性与定量GMO(遗传改良组织)检测序列特异性等位基因分型,SNP检测应用之一：病原体检测与定量绝对定量（特异基因的拷贝数－病原体的多少）标准品（如质粒）：梯度稀释未知样品阴性对照（NTC）如何确定标准品的量标准品是通过某种方法制备得到的已知拷贝数的含有目标片段的核苷酸序列通常通过紫外定量等方法测得浓度C(ng/uL)通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出标准品的分子量B这样拷贝数A(copy/uL)为：

A=C/B*6.02E+14应用之一：病原体检测与定量1432应用之一：病原体检测与定量HCV(FAM)RNAvirus65bpampliconHIV-1(HEX)RNAVirus74bpampliconHBV(CY5)DNAvirus81bpampliconTaqmanTriplexAssayDanielCandotti-Cambridge,UK应用之二：基因表达差异分析相对定量：基因表达量上升或者表达被抑制的倍数两种样品：Calibrator（对照，如正常组织）与Sample（待测样品）两个基因：目的基因与看家基因应用之二：基因表达差异分析RNA抽提RT定量PCRcDNA产物系列稀释两个基因的扩增效率Normalizer看家基因应用之二：基因表达差异分析CalibratorSampleGeneofInterest目的基因CtCtCtCt

Ct1

Ct2应用之二：基因表达差异分析基因表达差异＝2

/2

Ct1

Ct2＝2

Ct1-

Ct2这个公式的前提是看家基因和待测基因的扩增效率相同且都为1Xn＝X0(1+E)n基因表达相对定量分析实例采用SYBRGreenI的方法研究Mal基因在食管癌中的表达状况；采用看家基因GAPDH作为内参样品采集，新鲜食管癌标本和远端正常组织抽提总RNA，电泳检测质量通过紫外分光光度计检测RNA含量取500ng的总RNA参加反应合成cDNA总RNADNaseIcDNA总RNART无RTRNaseHcDNARNaseH无检查是否样品中有基因组DNA污染真正用于检测的样品样品的准备和处理肿瘤和正常标准品的准备选择某种已知表达较高的组织或细胞作为标准品来源提取总RNA，样本处理方法同前经梯度稀释：1：10；1：100；1：1000；1：10000；1：100000并自己给稀释的标准品定义数值：10000，1000，100，10，1等Mal基因引物GAPDH基因引物标准品正常样品标准品肿瘤样品正常样品肿瘤样品Ct1cbCt2cb扩增效率扩增效率无RT产物无Ct1sCt2s肿瘤样本和正常样本的相对表达差异应用之二：基因表达差异分析GAPDHMal表达倍数差异（肿瘤/正常）copy数相对值Xcopy数相对值Y校正后Y/X正常样品5482130560.5570.5570.129肿瘤样品87251.599970.1140.072结果计算方法说明在肿瘤样本中Mal的基因表达量有显著下调，只相当于正常样本的0.129倍两条探针分别针对不同等位基因ACGTACGT应用之三：SNP分析应用之三：SNP分析FAMTETFAMTET荧光定量PCR仪的硬件条件激发热循环－加热、制冷样品检测荧光定量PCR仪应满足的要求光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料能分开不同荧光素的激发光与发射光波长能检测的灵敏度与动态检测范围准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.荧光定量PCR原理及应用荧光定量PCR实验引物/探针设计及实验条件优化StratageneMx3000P荧光定量PCR仪QPCRAssayOptimizationDesignSynthesisTestoligosOptimizationPrimersProbeEnzyme,

dNTP,Mg++Serial

dilutionRunandAnalysisTarget/AmpliconChoiceTargetsize:50-150bpfordual-labeledprobes(Taqman)200-400bpforSYBRIfusingacDNAtemplate,spanintronstoavoidgenomicDNAcontamination.Trytoavoidrepetitiveorhighlystructuredregions(CpGislandsandcontrolregionsatthe5’endtendtoformcomplexstructures).QPCRPrimerPropertiesUsethesametargetannealingtemperatureforallyourprimerstofavormultiplexinginthefutureandrunsinglethermalprofileTypically55-60°C(with1°Ctempdifference)AvoidG/Cclampsatthe3’end.Ifrequestedbythesoftware,use100mMmonovalentcationand5mMMg++forprobes,2.5mMforSYBR.AlwaysBLASTyourprimers.Dual-labeledProbeDesignTm10°Chigherthanprimers.35-65%G/C;moreCsthanGs.Avoidrunsof3+ofthesamenucleotide,especiallyGs.5’baseG.3’endofprimerand5’endofprobeonsamestrandbetween1-15bpdistance.Testthatprimersandprobearenotcomplementarytoeachother.Reporter-QuencherPairs

Dye QuencherFAM BHQ-1/TAMRAHEX/JOE BHQ-2TexasRed/ROX BHQ-2Cy5/Quasar670 BHQ-2(or-3)OligoSynthesisPrimers:Usedesaltedprimersforsequence-specificdetection.SYBRGreenprimersshouldbeHPLC-purified.Aliquotstocksolutionof20x(asdeterminedbytheoptimizationstep),typically6-18μMeacholigo.Testprimersbeforeorderingprobe.Probe:Ensurematchingfluorophore/quencherset.Double-HPLCpurified(purificationalsoOK).Aliquotworkingstockat2-4μM(20x).InitialPrimerTestingPrimers:PCRreactionandelectrophoresis.SYBRGreenrunanddissociationanalysis.MeltingCurveAnalysisGoodProbePerformancedRn=0.1to0.9PoorProbePerformancedRn=0.1to0.4

QPCRAssayOptimization

Firstoptimizeprimers(applicationspecific):performprimermatrixassayconfirmoptimalprimerpairwithstandardcurvesensitivityordynamicrangechallengesmultiplexingSecondoptimizeprobeconcentrations:performprobematrixassaywithoptimalprimerpairconfirmoptimalprobeconcentrationwithstandardcurveLastlyoptimizeMg++concentration:

usuallylaststeptoattemptifassayisstillnotperformingoptimallyifmultiplexing,chooseasetconcentrationfortheassay

QPCRAssayOptimizationPrimerconcentrations:100-600nM(startwith300nM).50-300nM(150nM)forSYBRGreen.Probeconcentrations:50-300nM(startwith200nM).Mg++concentration:3.5-5.5mM(startwith5mM).1.5-3.5mM(2.5mM)forSYBRGreen.WhyOptimizePrimers?Goalistogetprimersperformingoptimallysoforwardandreverseprimersannealtosequenceatequalefficiency.Primerannealingisasequencedependentevent.StandardPCRoptimizationusedthermalgradienttofindanannealingtemperatureforwhichbothprimersworkedwelltogether.QPCRhashighersensitivityallowingmorepreciseprimeroptimization.PrimerOptimizationMatrixTwoSchemes:Optimizeconcentrationofforwardandreverseprimersandtotalprimerconcentration.(100-600)or(100,300,600)etc…SYBR:50,150,300Optimizeconcentrationofforwardandreverseprimerswithsametotalprimerconcentration

(Taqman600nMtotal)(SYBRGreen300nMtotal)PrimerConcentrationOptimizationLowestCtIfusingSYBRGreen,cleanmeltcurvesMinimalreplicatevariabilit