第二章-基因工程

第二章基因工程一、基因工程的含义第一节

基因工程概况

基因工程（geneticengineering）狭义：指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行剪接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状。DNA重组技术（DNArecombinant）基因重组（generecombinant）基因克隆（geneclone）、分子克隆、DNA克隆广义：DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（狭义的基因工程）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞（生物体）的大规模培养、基因产物的分离纯化及其应用等。基因工程的内容：分子水平操作、细胞（个体）水平表达、基因工程应用二、基因工程的技术流程目的基因的获取

载体的准备重组DNA的制备重组DNA的转化/转染重组体的筛选与鉴定重组体的表达、分析与开发应用基本条件：目的基因、载体、工具酶和宿主细胞。外源DNA在寄主细胞内可大量扩增和高水平表达外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖跨物种性无性扩增定向改良物种、创造新物种特征三、基因工程的技术策略强化特定基因的表达

改善生物性状

关闭特定的基因表达基因的异源表达，赋予生物新的功能

技术策略强化特定基因的表达增加目标性状有关的代谢途径中限速酶基因的拷贝数，提高表达酶的活性；使用强启动子驱动目标基因，提高目标产物的合成量；提高目标途径激活因子的表达，提高其所触发相关基因的表达。关闭特定基因的表达关闭目标代谢途径的抑制蛋白的编码基因或应用不受反馈抑制的突变基因，提高目标代谢流；阻断与目标途径相竞争的代谢途径，提高目标途径产物的产量；基因治疗。基因的异源表达赋予生物新的功能

具有特定功能的蛋白质编码基因的异源表达，使转基因生物能合成目标蛋白；利用已有的途径构建新的代谢支路；转移特定途径多个酶的编码基因，使转基因生物获得新的目标产物合成的能力。DNA是遗传物质四、基因工程的诞生噬菌体转染实验肺炎双球菌转化实验1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNA。

准备阶段1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构，按照双螺旋模型，在细胞分裂时，DNA的合成应是“半保留复制”的模式DNA双螺旋结构1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”

DNA

RNA

Protein1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等破译了64个遗传密码中心法则和遗传密码技术突破“基因剪刀”－限制性内切酶的发现“缝纫针”—DNA连接酶的发现“交通工具”—载体大肠杆菌转化琼脂糖凝胶电泳基因工程的诞生Berg的开创性实验Boyer-Cohen实验1980年Nobel化学奖1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：成功将SV40的DNA片断与

噬菌体的DNA片断连接起来。Berg的开创性实验EcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNABoyer-Cohen实验1973年斯坦福大学的S.Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性（pSC102）。把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出了相应的RNA，首次证实真核基因可转移到原核生物细胞并表达。这是第一次成功的基因克隆实验StanleyCohenHerbBoyer1986年Nobel生理医学奖基因工程的发展一系列新的操作技术构建了多种供转化（转导）原核生物和动、植物细胞的载体，获得了大量转基因菌株；

1981年：显微注射培育出第一个转基因动物（转基因小鼠）；

1983年：农杆菌介导培育出第一例转基因植物—转基因烟草；91-92年，转基因玉米与小麦获得成功。21世纪基因工程的应用研究开始进入鼎盛时期，在医、农、牧、渔等领域均得到了广泛的应用。

五、基因工程的理论基础理论基础：需要生物化学、分子生物学、分子遗传学、细胞生物学、微生物学、生理学等学科的技术与理论知识。技术支撑：核酸操作技术、电泳技术、核酸与蛋白的分析技术、细胞（生物体）的培养与再生技术等。思考题1、基因工程的含义2、基因工程的技术流程与技术策略3、基因工程的基本条件4、基因工程的诞生与发展5、基因工程与其他学科的关系一、限制性核酸内切酶二、DNA连接酶三、DNA聚合酶四、核酸修饰酶五、核酸外切酶六、核酸内切酶七、RNA酶第二节

基因工程的工具酶

一、限制性核酸内切酶RestrictionEndonuclease（RE）：一类能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并切割DNA双链的核酸内切酶。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII。寄主控制的限制与修饰体系：（restriction/modification，R/M体系），与免疫体系类似，能够辨别自己的DNA和外来的DNA，并使后者降解掉，而寄主自身的DNA被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别与切割。属名种名株名EscherichiacoliR

大肠杆菌

EcoRI，EcoRV同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶命名分类：I、II、III型I型1-1.5kbcutRecognizesite随机切开一条单链作用时需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）

EcoRI的识别序列与切割位点5’…GCT

GAATTCGAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’

II型识别双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），切开识别位点处双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend），与DNA的来源无关。在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、

Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。EcoP1:AGACCIII型距识别序列下游24-26bp处核酸限制性内切酶的类型及主要特性主要特性I型II型III型限制修饰双功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMMg2+ATPSAMMg2+识别序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋转对称序列CAGCAGGAGCC切割位点距识别序列1kb处随机性切割识别序列处特异性切割距识别序列下游24-26bp处DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用无用基本特性:双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构

EcoRI的识别序列与切割位点5’…GCT

GAATTCGAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’

II型限制性核酸内切酶DNA上ER识别序列的出现频率:

识别序列的频率=1/4N

Sau3A(4bp)=1/44256bp

EcoRI、PstI(6bp)=1/464096

NotI(8bp)=1/4865536(rarecutters)

仅是理论推测同裂酶（Isoschizomers)：识别位点的序列相同的限制性内切酶。HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’

HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’

完全同裂酶：识别位点和酶切位点完全相同。如HindⅢ和HsuI。XmaI5’-C

CCGGG-3’3’-GGGCC

C-5’SmaI5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’

不完全同裂酶：识别位点相同，但酶切位点不同。如XmaI和SmaI。同尾酶(Isocaudamers）：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、XhoⅡ等

BamHI5’-G

GATCC-3’3’-CCTAG

G-5’XhoⅡ5’-U

GATCY-3’3’-YCTAG

U-5’

U代表嘌呤；Y代表嘧啶。酶解反应体系与条件大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl2

10mMNaCl0-150mMDTT1mMVolume

20-100µlT37℃1-1.5hr0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶1U：在最佳反应条件下，一小时完全水解1µg标准DNA所需的酶量。DNA的纯度：DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。纯化DNA、加大酶的用量（1µgDNA用10U酶）、延长保温时间、扩大反应总体积（>20

l）。影响限制性内切酶活性的因素DNA的甲基化程度：基因工程中常使用甲基化酶失活突变的菌株。N6位引入甲基：受其影响的酶有BclI、MboI等；C5位上引入甲基：受其影响的酶有EcoRII等。缓冲液

MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。反应温度：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37℃，少数要求40-65℃。限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和识别位点的专一性。

星号（*）活性：如果改变反应条件，如：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性（变化），即所谓的Staractivity现象，或称限制性内切酶的星号（*）活性。在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：只有在相当特殊的条件下，酶活才与发表的结果相符，必须采用规范的实验步骤，坚持应用推荐的反应条件。底物位点优势效应（位点偏爱性）：

酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同CGCGGATCCGCGCCTAGGDNA的末端长度：限制酶切割DNA末端时，要求识别和酶切位点的两端必须有一定数量的核苷酸（保护碱基）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切；对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解；低盐酶先切，补加盐后，高盐酶再切；一种酶先切，更换缓冲液后，另一种酶再切。

多酶联合酶解

二、

DNA连接酶连接双链DNA上缺口处5’P与3’OH形成磷酸二酯键，连接与RNA链结合的DNA链上缺口处5’P与3’OH形成磷酸二酯键，连接多个平头双链DNA分子。大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端。T4DNAligase：由噬菌体编码，一条多肽链，能催化双链DNA或单链DNA（RNA）连接，但催化单链的效率低得多，需ATP作辅因子。不但能连接粘性末端，还能连接平末端。T4RNAligase：由噬菌体编码，催化单链DNA或RNA连接。热稳定DNAligase：耐热菌编码，需NAD+作辅因子，作用温度在45-65度。反应体系与条件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20µlT4-15℃4-16hr1U：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1µgλ-DNA（HindIII片段）所需的酶量。DNA浓度：外源片段浓度比载体浓度高10-20倍。温度：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持连接酶活性的最适温度却是37℃，因此最佳反应温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折中。经常采用12.5℃（4-16℃）。影响DNA连接的因素共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3’-OH端。主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。三、

DNA聚合酶DNA聚合酶3’

5’外切酶活性5’

3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高反应体系模板：DNA或RNA引物：sense和antisenseTaq酶：耐热DNA聚合酶dNTPMixture底物PCRbuffer：10mmol/LTris-HClpH8.4(20℃)50mmol/LKCl、Mg2+0.1mg/mL乙酰BSA合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。TaqDNA聚合酶延伸速度：约35-150nt/s.酶分子最长延伸长度：6.7kb热稳定性，耐高温没有3’

5’外切酶活性最适温度：75-80℃激活剂：金属离子敏感（尤其是Mg2+

）；50mmol/LKCl有利于变性，也能激活TaqDNA聚合酶的活性。

Taq的PCR产物3’端往往带有一个A。其它耐热的DNA聚合酶无3’

5’DNA外切酶活性，高温下既能逆转录cDNA，又能扩增DNA有3

5’

外切酶活性，能耐受100℃高温。TthDNA聚合酶VentDNA聚合酶PfuDNA聚合酶有3’

5’外切酶活性，是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低TaqPlusDNA聚合酶Taq和PfuDNA聚合酶的混合物5’

3’DNA聚合酶活性，不需要模板，随机添加dNTPs。1.末端脱氧核苷酸转移酶（terminaltransferase）四、DNA修饰酶用途：同聚物加尾，再生酶切位点；非放射性标记DNA片断的3’端。3’

dTTP，末端转移酶DNA5’TTT催化ATP中的

磷酸转移给双链/单链DNA/RNA的5’末端的OH。2.T4多核苷酸激酶5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

ATPT4多核苷酸激酶用途：

DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。3.碱性磷酸酶5’

3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH碱性磷酸酶用途：防止线性化载体分子的自我连接。五、核酸外切酶DNA外切酶切割方式识别位点单链大肠杆菌核酸外切酶I（exoI）5’

3’5’-OH大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’

3’3’

5’5’-P3’-OH双链核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’

5’3’-OH

核酸外切酶（

exo）5’

3’5’-PT7基因6核酸外切酶5’

3’5’-P5’-OH六、核酸内切酶1.单链DNA内切酶S1核酸酶，高度单链特异性，降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍，降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍。S1S1ATGCATGCATGCTACGTACGTACGT甚至能识别单个核苷酸的单链区！降解限制酶酶切形成的单链突出端在DNA上定位RNA（S1mapping）RNA某限制酶位点（参照物）DNAS1S1200bp400bp某限制酶切后再与RNA杂交RNA定位RNA不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。mRNADNA用mRNA测定基因中的外显子序列既有单链特异的DNA（RNA）内切酶，又有双链特异的DNA内切酶。2.Bal31核酸酶用途：诱发DNA分子发生缺失突变；定位测定DNA片断中的限制酶的酶切位点分布。与对照组（不用Bal31消化）只用相同的酶切的电泳比较。根据限制酶切片断消失的先后顺序，判断这些片断在原DNA中的位置。Bal31控制消化法：用Bal31消化线性DNA，并在不同的时间加入EGTA终止反应，再限制酶切和电泳。HindIIIBamHIEcoRIEcoRIBamHIHindIIIEcoRIMarkerHindIIIBamHIEcoRIMarkerBal31消化未用Bal31消化七、RNA酶RNaseA：

特异性地攻击RNA上嘧啶碱基的3’端，切割C(或U)与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。RNaseT1：特异性地作用于鸟嘌呤3’-P，切割在鸟嘌呤的3’-P和相邻核苷酸的5’-0H之间的磷酸二酯键。RNaseH：

特异地降解DNA：RNA杂合链中的RNA部分，产生不同长度的具有3'-OH和5'-P末端的寡核苷酸，不能降解单链或双链的RNA。思考题1、各种工具酶的特性及其在基因工程中的用处2、限制性内切酶的分类与作用特点3、影响II型限制性内切酶活性的因素4、多酶联合酶切与DNA重组第三节

基因工程载体

载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞内复制或表达的运载工具（DNA分子），即携带目的基因、并实现目的基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。一、定义

具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性），在宿主细胞内能独立稳定复制；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；具有多种核酸内切酶的单一识别与切割位点；具有合适的筛选标记；具有较高外源DNA的载装能力；容易从宿主细胞中分离纯化；安全。二、载体应具备的条件按来源：质粒、噬菌体、病毒、人工染色体等按产物：克隆载体、表达载体按宿主细胞：原核细胞载体、真核细胞载体三、分类基因工程中常用的载体：质粒（plasmid）、单链DNA噬菌体载体、

噬菌体载体、噬菌粒、柯斯质粒（cosmid）、人工染色体、病毒（virus）四、大肠杆菌质粒载体

质粒（plasmid）：独立于染色体以外的能自主复制的、并能稳定遗传的双链闭合环状DNA分子。大肠杆菌的质粒1、基本特性分子小：

1—200kb编码基因少：

2—3个中等大小的蛋白质如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）环形状：双链环状DNA，（酵母的“杀伤质粒”是RNA）质粒的空间构型：SC、

OC、L共价闭合环状DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)

，呈超螺旋（supercoil，SC）。开环DNA（opencircular，OCDNA），一条链上有一至数个缺口。线形DNA（

linear，LDNA）携带特殊的遗传标记：野生型质粒DNA上一般携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主产生正常生长非必需的附加特性。物质抗性：抗生素、重金属离子、有机物等物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱等R质粒（抗性质粒）：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）Col质粒：带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。质粒的可转移性：接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等；非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用，如Col、R的其它成员；某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移。自主复制性：质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。严紧型质粒（stringentplasmid）：拷贝数少，只有1—3份拷贝（接合型质粒）。松弛型质粒（relaxedplasmid）：拷贝数多，有10—60份拷贝（非接合型质粒）。质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。如大肠杆菌的质粒：ColE1、pMB1有相似的复制子结构，彼此不相容；pSC101、F有相似的复制子结构，彼此不相容。2、载体的构建天然质粒的局限性：分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、筛选标志不理想。ColE1质粒：

6.5kb，拷贝数20-30，大肠杆菌素E1（E1能杀死不含ColE1质粒的菌形成“噬菌斑”）。pSC101：分子长9.1kb，只有一个EcoRI切点充当克隆位点，拷贝数5，Tetr

。质粒载体必须具备的基本条件具有复制起点（Ori）具有遗传标记：抗性基因、LacZ若干限制性内切酶的单一位点（multiplecloningsites,MCS）具有较小的分子量具有较高的拷贝数在细菌中稳定存在氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性

（Kanr）四环素抗性

（Tetr）链霉素抗性

（Strr）氯霉素抗性

（Cmlr）抗菌素抗性选择标记：抗菌素抗性类标记和颜色反应类标记（lacZ’显色）。氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）：通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌，

Ampr基因编码

-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的

-内酰胺环。常用抗菌素的抗性工作原理：氯霉素（chloramphenicol，Cml）：通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成，杀死细菌。Cmlr

编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。卡那霉素（kanamycin，Kan；新霉素Neomycin，Neo）：通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读，杀死细菌。Kanr

编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。链霉素（Streptomycin，Str）：通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译，杀死细菌。Strr

编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。四环素（Tetracycline，Tet）：

通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成，杀死细菌。Tetr

编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，阻止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。lacZ的显色原理

-半乳糖苷酶

乳糖半乳糖葡萄糖++Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝深蓝色Xgal：5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷载体上带有

-半乳糖苷酶基因的

片段（氨基端，LacZ’），其上有外源DNA的插入位点。MCS受体菌基因组中带有突变的

-半乳糖苷酶基因（lacZΔM15，

片段缺失）表达ω片端。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的

-半乳糖苷酶。

互补或蓝白筛选每个细胞的拷贝数1000—3000个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒低拷贝数的质粒载体pSC101派生质粒温敏质粒载体不适合大量扩增DNA用，表达某些毒性基因在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质3、人工构建的质粒载体的类型整合质粒：装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合穿梭质粒：装有针对两种不同受体细胞的复制子，便于基因克隆探针质粒：装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选表达型质粒载体：主要用来使外源基因表达出蛋白质克隆载体元件复制起始点Ori选择标记多克隆位点MCS大肠杆菌操纵子元件阻遏基因I和操纵基因O启动基因P核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区4、经典的大肠杆菌质粒载体低拷贝天然质粒第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体24个克隆位点：其中9个会导致Tetr基因失活；3个会导致Ampr基因失活。复制起点ori：pMB1系列抗性基因：pSP2124质粒的Ampr和pSC101的Tetr分子小，克隆能力大，高拷贝数：氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy；安全:失去了转移蛋白基因mob（mobilization），不能通过接合转移。PBR322的改进：

删除mob识别位点，进一步增加质粒的拷贝数。pUC18/19MCSpUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11pUC18、pUC19pBR322的ori、

Apr基因（突变）lacZ的操纵子结构：启动子、lacI、lacZ’基因Amp抗性和lacZ的

肽互补（蓝白斑）相结合。优点：更小的分子量、选择方便、克隆便利、测序方便pGEM-3Z：由pUC派生而来。与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6，可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。T7启动子SP6启动子MCSlacZ’

AproripGEM-3Z的特点：如果加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA外源基因，正接反接都可以转录，MCS与pUC18的完全一样。pGEM-4Z：与pGEM-3Z相同，只是T7启动子和SP6启动子的位置互换。穿梭质粒载体（shuttleplasmidvectors）人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。Yeast复制起点E.coli复制起点E.coli选择标记Yeast选择标记MCS大肠杆菌

蓝藻穿梭载体大肠杆菌

酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌

动物细胞穿梭载体克隆、构建表达E.coliAnimalcell穿梭载体的优点：利用大肠杆菌进行基因克隆、利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达；可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。五、噬菌体载体

噬菌体是一类细菌病毒，蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。噬菌体（Bacteriophage）是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定条件下上述两种状态还会相互转化。+DNA（ssDNA）；复制型（RF）是双链环状DNA；RFDNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌；产生噬菌斑；不存在包装限制；可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。1、单链噬菌体载体特点单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：M13、f1等M13噬菌体外型呈丝状；由外壳包装蛋白和正链DNA组成；不裂解宿主细胞，但抑制其生长。克隆区域的选定：基因间隔区（intergenicregion,IG区）基因II与基因IV之间存在的一段507bp，含有复制起点。M13载体的构建酶切位点：IG区内只有一个BsuI切点，其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。加入酶切位点：

在IG区内加入单一内切酶位点。第一个M13载体：M13mp1，在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（

-肽序列)，利用

-肽序列中的三个单一酶切位点（BglII、AvaII和PvuI）。M13载体系列M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19对应有相同MCS的pUC系列载体：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11pUC18、pUC19多克隆位点与pUC18/19相同子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA，定向突变、测序、探针。优点有MCS，便于克隆不同的酶切片段；Xgal显色反应，可供直接选择；可以克隆双链DNA分子中的每一条链。缺点：插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降实际克隆能力小于1500bp。由G.P.Smith1985年发明。将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。噬菌体展示载体（Phagedisplayvector）丝状噬菌体（M13、f1等）外壳颗粒的一端，有3-5个基因Ⅲ编码的蛋白质（g3p），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用。M13cos位点（cohensive-endsite）：

DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。2.双链噬菌体载体--

载体

DNA分子的特点：长度为48502bp；双链线DNA；在DNA的两端有cos位点，可以环化。λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体，由外壳包装蛋白和λ-DNA组成。

DNA进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（RFDNA）。特点：

DNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成基因至阻遏基因之间的区段）。

genome(48502bp)cI表达：溶原状态Xis和Int的协同表达：溶菌状态缩短长度，删除

噬菌体的非必需区，留出插入外源基因的空间；在非必须区内制造限制酶切点；引进某些突变表型，作为选择标记；突变某些基因，使它成为安全载体；删除

DNA必须区段上多余的常用限制酶切点（

噬菌体DNA上本身有5个EcoRI和7个HindIII切点！）

噬菌体载体的构建：包装范围既不能超过正常野生型容量的5%；又不能低于正常野生型容量的75%，即36-51kb。标记基因Imm434标记基因：编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物；含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，λ-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。LacZ基因：蓝白筛选构建琥珀密码子的突变体：琥珀型突变（supE

)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码的校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型λ-DNA上D和E两个头部包装蛋白基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种λ-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。插入型载体（insertionvectors)：如

gt10、

gt11、

BV2、

NM540、

NM1590、

NM607免疫功能失活型：插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因，Imm434标记基因）内。EcoRIcI

gt10类型：选择标记：插入外源DNA导致载体不能合成阻遏物，

载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。

没有外源DNA插入的

载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。

-半乳糖苷酶失活型载体：在

基因组中引入了LacZ’序列。（其上含有一个EcoRI克隆位点）。选择标记：感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。LacZ’

EcoRICharon16A替换型载体（substitutionvectors)：两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于

DNA的非必须区两端。用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。

MCSMCS可置换区如：

EMBL4、Charon40等。野生型

DNA的必须区是28kb，所以

载体的最大克隆容量是23kb（实际上为15kb）。λ-DNA作为载体的优点：λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌；λ-DNA载体的装载能力为23kb，远远大于质粒的装载量，用构建真核生物基因组文库；重组λ-DNA分子的筛选和提取较为方便。1.噬菌粒载体（phagemidvectors）：质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。六、大肠杆菌人工载体MCS噬菌体ori质粒oriAmprlacZ’

lacI特点：分子量小，约3000bp（比M13小），克隆能力大，能插入10kb的外源DNA。MCSpUCoriAmprlacZ’

lacIM13ori3.2kb

pUC噬菌粒载体系列

pUC118、

pUC119SK：表示lacZ’的转录方向与MCS上的SacI

KpnI相同KS：反向（KpnI

SacI，MCS相反）pBluescriptSK（+/-）/pBluescriptKS（+/-）由pUC质粒载体、f1噬菌体的复制起点、T3与T7噬菌体的启动子组成。pBluescript噬菌粒载体（pBS）pETBlue-2克隆／表达区域1978年J.Collins和B.Hohn等人发展出cosmidvector（cossite-carryingplasmid)，4—6kb。

DNA：cos序列和控制包装序列（包装识别）质粒：质粒的复制子抗药性基因多个限制性酶的单一位点不携带包装蛋白基因，重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒，不裂解受体细胞。2.cosmid载体（粘粒）具有

噬菌体的特性：在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌

），克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。具有质粒载体的特性：大多带有pMB1或ColE1的复制子，能象质粒一样复制。方便的选择：有抗菌素抗性基因和插入失活的克隆位点。高容量：31-45kb（最少不能低于30kb）。特点：F质粒的特点：单拷贝复制；克隆容量可达300kb；比较稳定，每细胞只有一个拷贝，不会重组；便于提纯，像提取质粒一样直接提纯。3.细菌人造染色体BacterialArtificialChromosomes，BAC：将细菌接合因子的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体，其装载量范围在50-300kb之间。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。BAC的组成结构OriS和repE控制质粒的单向复制。parA和parB维持低水平质粒拷贝数。CosN是噬菌体末端酶专一性切割位点。HindIII和BamHI是插入位点。两侧的NotI可用于切下外源DNA。氯霉素抗性基因Cmr七、PCR产物克隆载体--T载体MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAA八、酵母载体YEp质粒：以酵母2um质粒上的复制元件为复制子的质粒。YRp质粒：

以酵母ARS为复制子的质粒，（ARS酵母染色体上的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件）。酵母的表达载体均为大肠杆菌／酵母穿梭载体。酵母大肠杆菌YRp和YEp质粒在酵母中的拷贝数高达200，因分配不均，培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%。YCp质粒：将CENDNA插入含ARS的质粒中（CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列），YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个。YIp质粒：在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列（酵母菌染色体DNA同源序列）和标记基因。以便目的基因高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。特点：克隆容量大，为230kb-1700kb。构建原理：按染色体结构构建。酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC)TELTELCENORI染色体复制和遗传的三个基本组件：DNA复制起始点（ori）、着丝粒（centromere，cen）、端粒（telomeres，tel）端粒（TEL）：

酵母端粒保守序列是(G4T2)n

重复序列。复制起点（ORI）：约100bp的自主复制序列（ARS）YAC的构建：酵母染色体的端粒序列、复制子、着丝粒序列、选择标记，大肠杆菌的复制子和选择标记。克隆位点：位于

SUP4

基因内部。在酵母中的标记基因:TRP1、URA3（位于两臂）和SUP4在细菌中操作:细菌的复制起点ori和抗生素标记AmprTRP1色氨酸合成基因，URA3尿嘧啶合成基因，SUP4

赭石突变抑制基因。插入失活选择：

SUP4酶失活的酵母菌落呈红色；不失活的菌落是白色。宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1，该酵母菌在基本培养基上形成红色菌落；当含sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。YAC克隆外源DNAURA3TRP1CEN4宿主酵母菌：

trp-

和

ura-选择方式：

只有同时得到YAC的两个臂，才能在基本培养基（不加Trp和Ura）上生长。centrp1ura3YAC的缺点：存在插入子的稳定性问题；同一酵母细胞内多个YAC引起交换；转化效率低；难以制备纯的YAC-DNA。九、植物载体Ti、Ri质粒和病毒载体。农杆菌：生活在植物根表面，依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。在自然条件下，农杆菌能趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导其产生冠瘿瘤或发状根。分为根瘤农杆菌（Agrobacteriumtumefaciems）和发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有染色体外的遗传物质：Ti质粒和Ri质粒。Ti（tumor-inducing）质粒和Ri(root-inducing)质粒上有一段T-DNA（transferredDNA），农杆菌侵染植物伤口进入细胞后，可将质粒上的T-DNA插入到植物基因组中。农杆菌是一种天然的植物遗传化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。Ti质粒主要功能区域：Ori、T-DNA区Vir区、Con区。pTiC58ABCDT-DNACONVirOri根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，双链闭合环状DNA分子，200kb-500kb；T-DNA：农杆菌感染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，该DNA片断上的基因与肿瘤的形成有关。T-DNA的两端含有25bp左右不完全直接重复序列，右端的序列为右界(rightborder，RB)，左端的为左界(leftborder，LB)。RB和LB：直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，而T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失（卸甲）后，将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。一般在转化植物细胞的二倍体基因组中含有一个或几个T－DNA拷贝。Vir区（virulenceregion，毒性区）：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。Con区（regionsencodingconjugations）：该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移，因此称之为接合转移编码区。Ori：该区段基因调控Ti质粒自我复制的起始。pTiC58ABCDT-DNACONOri章鱼碱型胭脂碱型pTiC58pTiAch5T-DNATL

TR

Ti质粒的改造除去T-DNA上的生长素（tms）、分裂素（tmr）生物合成基因和有机碱生物合成基因（tmt）；除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安装植物细胞的筛选标记（如neor

基因）和植物基因的启动子和polyA化信号序列；安装多克隆位点以利于外源基因的克隆。二元载体：由两个分别含T-DNA和Vir相容性Ti质粒构成的双质粒系统。克隆质粒：用于克隆外源基因片段，为大肠杆菌和农杆菌穿梭质粒，容易操作；大肠杆菌Ori农杆菌OriT-DNA大肠杆菌农杆菌穿梭质粒目的基因GusAPrCatrTi辅助质粒：具有毒性基因，没有T-DNA序列。将两种质粒分别导入农杆菌中，同时存在时可恢复T-DNA的转移功能，经农杆菌介导，克隆质粒中的外源基因转移到植物染色体中。其基本结构与Ti质粒相似，具有2个和致病相关的区域，即致瘤区(vir区）和转移进入细胞核的T-DNA区。转化机理与Ri质粒的基本相同。Ri质粒单一基因组病毒：如马铃薯Y病毒；多分体基因组病毒：病毒基因组分装在多种病毒外壳中，形成几个颗粒，如黄瓜花叶病毒组(CaMV.3)、苜蓿花叶病毒组(AMV13)；dsDNA病毒：如花揶菜花叶病毒（CaMV，在专一位点有不连续性，有35S强启动子，易表达）；

dsRNA病毒（反转录病毒）。植物病毒载体十、昆虫表达载体杆状病毒杆状病毒为单一闭合环状双链DNA病毒，基因组大小为90-180kb，可在昆虫细胞核内复制和转录。

病毒基因组较大，可插入相当大的外源DNA片段，是表达大片段DNA的理想载体。作为表达载体的杆状病毒多核型多角体病毒(multiplenuclearpolyhedro-sisvirus，MNPV，AcMNPV或AcNPV)，能感染30多种鳞翅目昆虫家蚕核型多角体病毒（bombyxmoil，BmNPV)AcNPV基因表达立即早期基因表达早期基因表达晚期基因表达极晚期基因表达基因表达早于DNA复制基因表达伴随着一系列病毒DNA合成AcNPV极晚期基因表达的两种高效表达蛋白多角体蛋白：包含体的主要成分，病毒复制非必需成分，对病毒粒子有保护作用，可使之保持稳定和感染能力，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％；P10蛋白：病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关；这两个基因的启动子具有较强的启动能力，该位点为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。杆状病毒的基因组庞大，其作为外源基因的表达载体，外源基因的克隆不能通过常规的酶切连接的方式直接插入病毒载体；通常通过体内同源重组的方法，用外源基因替代病毒的非必需编码基因而构建重组杆状病毒。常用启动子多角体蛋白编码基因启动子P10蛋白编码基因启动子家蚕丝心蛋白启动子家蚕:丝心蛋白外源基因通过转移载体（供体）的介导在大肠杆菌细胞内以同源重组的方式克隆入受体病毒载体，将要表达的外源基因插入启动子下游。转移载体多元表达载体：含有两个或多个相同或不同的启动子，可同时表达两个或多个外源基因单一表达载体：单启动子下游插入多克隆位点，可以导入不同的外源基因

pFASTBAC~130kbBacmid（baculovirusplasmid，baculovirusshuttlevector，杆状病毒穿梭载体）筛选DH10BacHelperplasmid：表达转座酶重组病毒转染昆虫细胞测定病毒滴度草地夜蛾sf9或21转染昆虫细胞蛋白表达标记基因TK基因：胸苷激酶，TK合成TMP，氨基喋呤为该酶的特异抑制剂。Neo基因：磷酸转移酶基因，可使氨基糖苷类抗生素G418失活，G418是一种蛋白质合成抑制剂，可干扰真核细胞80S功能。GFP：绿色荧光蛋白GUS基因：β-葡萄糖苷酸酶，5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷酸（X-gluc）启动子：起始位点上游20bp处的TATA盒，RNA聚合酶开始装配和转录的地方；CAAT盒和GC盒，调节转录的起始。增强子：增强子序列是决定基因表达强度和基因表达空间与时序的重要元件。SV40增强子，人巨细胞病毒（CMV）增强子，逆转录病毒LTR增强子等。十一、哺乳动物表达载体RNA剪接位点和内含子：内含子一般含有决定基因表达强度和时空专一性的构件，一些启动子可和内含子相互作用提高表达水平。非翻译区序列（5’UTR和3’UTR）：5’UTR的长度至少大于20bp。起始AUG及其周围序列。哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号，可视实验需要加入标志基因、复制起始点序列、内部核糖体进入位点等。外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。

载体的结构元件人巨细胞病毒早期启动子（CMV-IE）人延伸因子1-亚基启动子人leukosialin（CD43）基因启动子鼠3-磷酸甘油激酶l（PGKI）基因启动子UbiquitinC基因启动子核内小RNA（snRNA）启动子鼠乳房瘤病毒(MMTV)启动子等

常用的强启动子Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列人巨细胞病毒增强子鼠乳房瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR)低氧反应增强子等

常用的增强子常用高等哺乳动物的表达载体质粒型表达载体病毒型载体定向打靶载体质粒型表达载体腺病毒（adenovirus），线状双链DNA病毒（36Kb），基因组中有14个基因，带有倒置的末端重复（ITR），在病毒的复制过程中起非常重要的作用。ITRITR腺病毒载体：是目前最常用的动物病毒载体之一。人腺病毒的基因组DNAIVa2VAL1L2L3L4L5ITRITR

E1E2E3E4E1、E3为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关。E1是腺病毒繁殖的必需区，E3编码晚期基因的调控因子，E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能。腺病毒穿梭载体：含有E1

或E3

的同源序列。腺病毒的包装上限为原基因组的105%；构建载体时除去E1

或E3片段，使得载体的装载量提高到4kb以上。质粒线性化，与腺病毒一起共转染细胞，在细胞中发生同源重组，把外源DNA加到病毒基因组中，并包装成重组病毒颗粒。腺病毒DNA载体的优点：基因重排低：外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期；安全性能好：不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤；宿主范围广：对受体细胞是否处于分裂期要求不严格；使用效果好：外源基因在载体上容易高效表达。感染方式多：可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式感染。猴多瘤病毒（SV40）载体猴多瘤病毒40(simianvirus40）属乳多瘤病毒科多瘤病毒属，基因组为5224bp的双链环状DNA，与质粒大小相似，适于基因操作；每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白。pV2-GPTSV40oriviralgenegptAprpBR322oriSV40穿梭载体gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因缺陷的SV40辅助病毒分离病毒DNAori病毒晚期基因启动子SV40载体重组分子筛选标记插入外源基因转化筛选增殖感染SV40DNA载体的特点：基因表达好，外源基因能高效表达；基因重排高，病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象；宿主范围窄，只能转染猴细胞；装载量较小。人乳多瘤病毒（BKV）载体属乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA；感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自主复制；每个宿主细胞最高可达500个拷贝；人乳多瘤病毒（BKvirus）人乳多瘤病毒表达载体的构建删除病毒核心蛋白和外壳蛋白的编码基因，与大肠杆菌质粒拼接，构成穿梭载体；安装细胞色素P450dioxin介导的增强子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子PMMT，由其带动外源基因的表达；SV40来源的启动子控制Neor

基因，以G418筛选重组子。BKV-E.coli

穿梭载体PSV40E.colioriAprBKVoriNeorBKVgeneDREPMMTAprMCS人牛痘病毒载体人牛痘病毒（vacciniavirus）：大型DNA病毒，基因组长185kb，能在宿主细胞质中自主复制；外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的病毒启动子的控制下高效表达；牛痘病毒基因组较大，体外DNA重组很困难，通常采用体内重组的方式进行。人牛痘病毒DNA表达载体的构建外源基因导入受体细胞之前，先用大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因的重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。外源基因T7启动子感染T7RNA聚合酶基因牛痘病毒启动子细菌重组质粒转化培养收集反转录病毒（ritrovirus）属于正链RNA病毒，显著的特点是具有2倍体基因组。两个相同的RNA分子在5’端附近通过氢键连接形成70SRNA，这种结构可能在逆转录过程中起调节作用。反转录病毒载体HIVInfluenzavirus

+：组装时必需的非编码序列；gag：核心蛋白；env：外壳蛋白；pol：反转录酶和整合酶；U5、U3：5’段或3’端独特序列。envpolgagU3U3U5U5cappolyA3’

5’

LTRLTRRR

+长末端重复序列（LTR）：在病毒基因组整合中至关重要。整合时，整合酶在U5-U3连接处切开双链DNA，随机插入到宿主基因组里。LTR本身还具有启动子和polyA加尾信号的功能。5’LTR

+外源基因neor3’LTR启动子删除pol、env和gag基因，插入标记基因和外源基因，在

+下游插入启动子。反转录病毒载体构建5’LTRgag3’LTRpolenv3’LTR5’LTR用两个缺失了

+的反转录病毒DNA与病毒载体共转化受体细胞，包装成病毒颗粒。转入的载体DNA上带有

+，转录成的载体RNA就会被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别，并包装成重组病毒颗粒。

高效转染靶细胞5’LTR

+外源基因neor3’LTR将DNA插入宿主基因组的随机位点上；侵染范围广、感染率高；整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，拷贝数目较低；包装的外源DNA可达10kb；反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。

反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞。优点基因打靶（genetargeting）：

通过DNA同源重组，使细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失或在基因组特定的位点插入外源基因。基因敲出（knock-out）基因敲入（knock-in）定向打靶载体基因打靶载体的要求：定点整合。要求能整合到染色体上特定的位置。整合的位置尽量选在基因组内的特定地方。必需整合在基因组中可以转录的区域。载体tk1HB1neor目的基因HB2tk2载体两段同源DNA序列（HB1和HB2）；抗性基因neor；胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）。载体tk1HB1neor目的基因HB2tk2载体HB1neor目的基因HB2染色体DNAHB1染色体DNAHB2染色体DNA染色体DNA染色体DNA只有目的基因和neor基因整合进去，tk基因不会整合。特异位点整合——同源重组染色体DNAHB1染色体DNAHB2染色体DNA载体tk1HB1neor目的基因HB2tk2载体染色体tk1HB1neor目的基因HB2tk2染色体两个tk基因至少有一个可能整合到基因组里。非特异整合——非同源重组正选择（positiveselection，neor基因）：

G418抗性选择，没有整合进neor基因的细胞都被杀死。负选择（negativeselection，tk基因）：表达的胸苷激酶能把GACV（9-1，3-二羟-2-丙氧甲基鸟嘌呤，ganciclovir）转化成有毒的核苷酸化合物，将含tk基因的细胞都杀死。筛选：正-负选择法哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-

氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR

二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR变体抗氨甲喋呤HPH-

潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-

胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-

黄嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-

腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA灭活Xyl--A思考题1、各类载体的结构特点及其在基因工程中的用处2、载体如何与受体细胞匹配？受体细胞：用于基因转移的受体菌或细胞。受体细胞应具备的条件限制性缺陷型：外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）；重组整合缺陷型：用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）；具有较高的转化效率；具有与载体选择标记互补的表型；感染寄生缺陷型，防止重组体扩散污染。第四节

受体细胞各种基因工程受体的特性大肠杆菌：遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定，适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达等，是DNA重组实验和基因工程的主要原核受体菌。枯草杆菌：遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素，适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌。酵母菌：具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定，适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、真核生物基因表达调控的研究等，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌。昆虫细胞（家蚕）：具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定，适用于真核生物基因的高效表达。链霉菌：分子遗传相对操作简便，不产内毒素，主要用于抗生素生产菌株的改良。哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）：与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统，适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体。植物细胞（拟南芥菜、烟叶）：转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用，适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良等。NovaBlue：来源于大肠杆菌K12基因型：endA1hsdR17(rk12-mk12+)recA1supE4