moflo XDP流式细胞仪基本原理以及应用

流式细胞仪基本原理以及应用

张宇eckmanCoulter细胞研究必备的仪器细胞成像、定位（单个细胞）细胞定量测定（群体细胞特征）分析型：一个细胞的身世：我是谁混杂的细胞群激光激发标记在细胞上的荧光素Directlytowaste仪器的电子系统收集荧光信号并处理信号计算机工作站对信号进行收集和统计流式细胞仪是通过对目标细胞上的荧光信号进行识别

而实现对细胞的定量一个细胞的命运混杂的细胞群身份的鉴定识别和通过的速度分选是一个复杂的过程流式细胞仪是细胞组学的定量工具可以做以下定量：细胞相对定量（％）细胞绝对定量（细胞/µl）细胞膜蛋白表达定量（蛋白分子/细胞）流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体流式细胞仪基本原理通过激光激发高速流动的细胞或微粒所携带的荧光染料或荧光素，并检测由此产生各种光信号，如散射光、自发荧光、特异性荧光的强弱，来反映各项待检测指标。成功的流式实验需要三步走：下游实验,培养或者其他生物手段验证流式样本制备单细胞悬液制备样本保存荧光标记设置对照单细胞悬液制备样本浓度要求：建议105~106/ml血样本样本要求：EDTA、肝素、柠檬酸钠抗凝全血凝血、溶血样本应当弃用

白细胞样本：需裂解去除红细胞

裂解液的选择：甲酸作用强，适用于一般检测

氯化铵作用温和，适用于低含量细胞

注意：温度过低会影响裂解效果

红细胞样本：PBS或生理盐水稀释1000倍

血小板样本：避免使用肝素抗凝血，PBS或生理盐水稀释20倍

培养细胞一般处理：消化分散成单细胞，过300目滤网去除细胞团块易聚集的细胞：可在缓冲液中加1~3%的小牛血清或BSA或0.05%EDTA

单细胞悬液制备组织细胞脾细胞，在缓冲液中将血洗净，剪成数块，直接在300目滤网上研碎过筛肝、肾组织及结肠癌等富含实质细胞的组织，于缓冲液中充分剪碎，细胞分散于缓冲液中，过100目滤网，再过300目滤网

肺、肠粘膜等结缔组织较多的组织，剪碎并用胰酶、胶原酶等消化分散骨、软骨、心肌、骨骼肌、脑组织等，可尝试机械剪碎及酶消化后于培养液中静置贴壁分离细胞，但可用的细胞往往较少，最好进行原代培养

单细胞悬液制备外周血样本：在不处理的情况下于4度存放3~5天，仍可用于大多数表面分子标记检测。但做细胞绝对计数应在24h内检测固定：低浓度的甲醛或多聚甲醛固定（<1%）可用于培养细胞或已分散成单细胞的组织来源样本的短期保存（<1周）

过高浓度的甲醛会影响抗原抗体结合及导致荧光淬灭，不适合流式检测长期保存：可参考细胞和组织的冻存（深低温或液氮）DNA倍体检测：可用-20度预冷乙醇固定（终浓度>80%），固定时震荡逐滴加入，避免结块，1~2ml/样本，存放于-20度（>1月）注意：已标记荧光的样本和对细胞活力有要求的样本应尽快检测，以免荧光淬灭及细胞活力丧失样本保存荧光标记表面抗原标记：抗体用量106cells/test冻干粉可以0.5~1ug/106cells为起始量脂溶性染料：可直接进入细胞内细胞内抗原标记及水溶性染料：需要膜通透试剂处理膜通透试剂的选择甲醇：中等，可能导致部分蛋白变性

皂素：温和，对细胞形态影响小

Triton-X100：强烈，对细胞形态影响大

商品化试剂：含有上述多种成分，不同组合用途不同荧光素的选择激发波长发射波长激光荧光通道荧光素的选择

CD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APCPerCP<FITC<APC<

ECD<PC5<PC7<PE荧光素的强度荧光检测通道之间的干扰FITC(F/PRatio3-5)PE(1/Antikörper)389D240kDECD(F/PRatio1)PC5(F/PRatio1)240kD240kD240kDTexasRed=625DCy5=1500DCy7=1001DPerCP(F/PRatio3-5)35kDAPC(F/PRatio1)105kDPC7(F/PRatio1)荧光素的大小荧光素的选择原则弱表达抗原选择较“明亮”的荧光素细胞内抗原检测优先选择小分子荧光素多色检测时弱表达抗原放在被干扰较小的检测通道，强表达抗原放在对其他通道干扰较小的检测通道表达互相排斥的抗原可以放在相互干扰较大的检测通道共表达的抗原避免放在相互干扰的通道上级抗原检测通道避免对下级抗原检测通道造成干扰SILENTUNTOUCHABLEUNTOUCHABLEUntouchable=其他染料没有干扰(cleanrow)Silent=不会漏进其他通道(cleancolumn)Distortion矩阵荧光补偿的调节

软件的手动、自动补偿和离线补偿

FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1-%FL2自动补偿2134检测的一般步骤设置检测方案（PROTOCOL)染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体）同型对照管调电压电压不变，补偿管调补偿电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果，确定分选目的细胞流式细胞仪基本结构Fluidicsopticselectronicsanalyzer液流系统Fluidics流体动力学聚焦原理管路设计光路系统激光滤光片光信号检测器MoFloXDP光路精致设计，开放性强Filter前向散射角（FS）侧向散射角（SS）电路系统如何看图DotPlot（双参数点图）Histogram（单参数直方图）Region（门）Statistics（统计结果）分选系统电极板分选仓分选原理（电荷式分选）晶体震动（200kHZ)液流充电系统高压偏转收集装置（管、孔板）MoFlo™XDP：喷嘴种类多，适合不同研究对象的需要

CytoNozzle

同等大小的罗纹卸载和安装，简单易用喷嘴内壁由生物活性材料组成，对细胞无损伤，确保最好的细胞活性XDP细胞√染色体/精子/细菌/大病毒颗粒/藻类细胞（50um）√实验动物细胞/人淋巴细胞/神经细胞（70-90um）√肿瘤细胞（100-130um）√巨噬细胞等真核生物细胞（150um）√植物/花粉/大藻类细胞（200um）Enrichmode要得到所有含有目标细胞的液滴Purifymode要得到所有含有目标细胞的液滴，但同时含有非目标细胞的液滴除外Singlemode只要只含有一个目标细胞的液滴目标细胞非目标细胞MoFlo:高度智能的分选模式Dropletscells液滴模式(Envolope)如下原则EnrichModeEnrichModePurifyModePurifyMode四路分选可以分别选择不同的分选模式独家的混合分选模式：四路分选分别选择不同的模式

既有高纯度细胞，又不浪费任何一个细胞XDPDataunpublishedShanghai右路：富集模式左路：纯化模式Sortedat>70,0