食品毒理学试验及安全性评价-食品毒理学试验设计（食品毒理与卫生课件）

食品毒理与卫生食品毒理学试验及安全性评价第一节我国食品的安全性毒理学评价1、定义：是指在未经实验之前对许多问题先予考虑和安排；

2、实验设计的目的：1）可以使实验者心中有数2）正确的统计方法处理3实验设计原则

1）对照原则

实验必须设对照组.2）重复原则一、毒理学实验设计1）单因素设计

自身对照设计

组间比较设计2）多因素设计

包括几个处理因素，每个因素又包括几个水平。3）序贯设计事先不规定观察对象的例数，每进行一次实验均由上一次的结果确定，不断增加观察对象的例数，不断进行检验，一旦可获得结论，实验即可停止，节约实验的人力和物力。4、实验设计类型1）明确实验目的一个实验一般只解决一、二个问题。2）查阅文献借用前人的经验。3）具体实验设计内容◆确定实验动物品种、数量◆选择观察指标◆实验动物如何分组◆染毒方式和染毒剂量◆统计处理方法◆安排实验进度5、实验设计内容和步骤二、实验动物的选择

1选择动物的原则：1）敏感。2）代谢方式与人接近。3）经济易得。2种属和品系的选择

观察化学物对实质脏器的损害——小鼠或大鼠

观察气体和蒸汽对粘膜刺激的作用——猫

观察毒物对皮肤的局部作用——豚鼠或家兔

观察呕吐反应——狗或猫

观察致敏作用——豚鼠

研究化合物的致癌、致畸作用——大鼠

观察神经毒——母鸡

测定半数致死剂量或浓度——大鼠或小鼠豚鼠家兔2种属和品系的选择1）体重的选择

急性实验——成年动物（小鼠体重18－25g、大鼠150－250g）

慢性实验——断乳不久的动物（小鼠体重10－15g，大鼠体重50－100g）

同一实验，各组动物的平均体重相差不超过5%，组间个体体重差异应小于10%2）一般选用雌雄各半动物进行实验3）实验动物必须发育正常

无外观畸形，体形丰满，被毛浓密光泽，行动灵活，反应敏捷，两眼有神，皮肤无溃疡或结疤，天然孔道干净无分泌物。3个体选择三、染毒方法的选择1、染毒物的制备1）了解纯度及成分，用同一批号受试物。2）染毒前将受试物制成一定的剂型，如水溶液、油溶液等。

溶于水的物质——蒸馏水或生理盐水作溶剂难溶于水易溶于油的物质——用花生油、豆油等不溶于水的物质——用淀粉（3%）、吐温80等助剂制成混悬液或乳剂。吐温-80吐温80是表面活性剂，其中的亲脂成份包括不饱和脂肪酸。大多数吐温产品则是微黄到棕色。医学界证实，使用吐温80是有严格限制条件的，它是一种有潜在不安全性的辅料，使用不当会对人或动物的健康造成很大影响。1）经呼吸道染毒2、染毒途径2）经消化道染毒（1）灌胃法（2）喂饲法（3）胶囊吞服法2、染毒途径3）注射染毒2、染毒途径4）经皮染毒2、染毒途径四、实验观察指标的选择1）灵敏性、特异性2）可参考同系化合物的毒理学资料3）接触者的临床表现4）慢性实验选用的指标可多一些五、实验质量控制1实验误差来源1）系统误差2）随机误差3）过失误差1）受试物的理化性质及纯度2）动物的种系差异和个体差异3）染毒方式及受试物配制的浓度和溶剂4）环境因素2、影响实验结果的因素六、毒理学评价程序1994年，我国卫生部正式颁布了《食品安全性毒理学评价程序和方法》标准（GB15193.1～15193.19-94）评价程序，2003年作了修改。◆本程序包括四个阶段（P271）1急性毒性试验2遗传毒性试验，传统致畸试验，短期喂养试验：3亚慢性毒性试验4慢性毒性试验1）属我国新创的物质，必需进行全部四个阶段的毒性试验。2）属与已知物质，可以进行前三阶段试验，并按试验结果判断是否需要进行第四个阶段试验。3）凡属已知的化学物质，WHO对其已公布ADI者，同时有资料证明我国产品的质量规格与国外产品一致，则可先进行第一、二阶段试验。如果产品质量或试验结果与国外资料一致，一般不要求进行进一步的毒性试验，否则应该进行第三阶段试验。

我国食品安全性毒理学评价程序对受试物还有以下的原则规定：第一阶段急性毒性试验1概念

是指一次给予受试动物或在24h内多次给予受试物所产生的毒性反应。2

目的1）了解受试物的急性毒性强度（LD50）和性质2）为蓄积性试验和亚慢性毒性试验的剂量的选择提供依据。3

实验动物1）动物为大鼠或小鼠。2)动物的年龄应选初成年。4

试验项目1）霍恩氏法—选择少许动物进行预实验，预估LD50。

寇氏法—先确定正式实验的最高和最低剂量。测定LD502）七天喂养试验—为亚急性和慢性实验剂量提供估计。

以上两项试验均分别用两种性别的小鼠或大鼠。第一阶段急性毒性试验

5结果判断1）如LD50或7d喂养试验的最小有作用剂量小于人的可能接触量的100倍者，则毒性太大，而不必再继续试验。2）如大于100倍者，则可进入下一阶段试验。第一阶段急性毒性试验

第二阶段亚急性毒性试验亚急性毒性试验是在急性毒性试验的基础上进一步检验受试物的毒性，对器官或生理功能的影响，以及估计发生这些影响相应的剂量，并可能指出需要做的特殊试验，它可为慢性毒性试验做准备。1概念：亚急性毒性试验是在相当于动物生命的1/10左右时间内使动物每日或反复多次接触被检化学物质的毒性试验。2目的：1）探索毒性作用和靶器官2）初估最小有作用剂量和最大无作用剂量3）为慢性实验的剂量设计提供参考4）为慢性实验筛选敏感指标3动物选择

大鼠应用较多

动物每组至少应有20只雌雄各半。

因其实验时间较长，应选用年幼的或初断乳的动物。4剂量选择：

一般采用1/5－1/20LD505亚急性毒性试验的试验期一般为1-3个月左右。6实验项目：蓄积性毒性试验；致突变试验；代谢试验第二阶段亚急性毒性试验

（1）蓄积性毒性试验：◆概念：如果一种外来化学物质反复多次进入机体，且其前次进入剂量尚未完全消除，后一次剂量又已经进入，以致这一化学物质在体内的总量不断增加，此种现象即为蓄积。◆目的：了解受试物在体内的蓄积性试验◆试验项目：1）蓄积系数法，用两种性别的大鼠或小鼠各20只。2）二十天试验法，用两种性别的大鼠或小鼠，每个剂量组雌雄各10只。以上两种方法任选一项。6实验项目（2）致突变试验

◆概念：致突变试验是检验外来化学物质有无引起突变作用的试验。突变可以发生在体细胞或生殖细胞。突变局限在个别基因位点上称之为基因突变或点突变；如果遗传物质的改变涉及到整个或部分染色体，称为染色体畸变。

◆目的：对受试物是否具有致癌作用的可能性进行筛选。

◆试验项目：1）体外试验：一般采用Ames试验。2）整体试验：a）微核试验和骨髓细胞染色体畸变分析试验中任选一项。b）显性致死试验和睾丸生殖细胞染色体畸变分析试验中任选一项。

6实验项目◆试验结果判定：①如三项试验均为阳性，表示受试物很可能具有致癌作用，除非受试物具有十分重要的价值，否则均不能通过。②如其中两项试验为阳性，由有关专家进行评议，根据受试物的重要性和可能接触量等，综合权衡利弊再作决定。③如一项为阳性，则可进入亚慢性毒性试验。④如三项试验均为阴性，则可进入亚慢性毒性试验。6实验项目第三阶段亚慢性毒性阶段1、定义亚慢性毒性是在3-6月的时间内使动物接触被检测物质的毒性实验。2、目的1）确定最大无作用剂量。2）致畸作用。3）为慢性毒性和致癌试验的剂量提供依据。3、动物选择：同亚急性毒性实验4、剂量选择：可根据急性和亚急性毒性试验中关于该毒物的资料来确定。一般至少设2个剂量组。

高剂量组应使动物引起阳性反应，但剂量又不能太高，否则动物死亡太多。

低剂量组应在整个试验期间不出现任何有害作用。有条件时可设3-4个剂量组，可以LD50的1/10，1/50，1/100，和1/1000设组。第三阶段亚慢性毒性阶段

（1）九十天喂养试验（2）喂养繁殖试验2:1交配，每2-3天称体重一次，若正常增长则无致畸，下降则有致畸。（3）喂养致畸试验

动物性成熟后给药，观察下一代的致畸性。（4）传统致畸试验

受孕的雌鼠给药，再分娩前24-48小时解剖观察致畸性。

以上项目均用两种性别的大鼠和/或小鼠。喂养繁殖试验中应观察的指标。产仔总数、平均仔重。

5、试验项目

以上试验中任何一项的最敏感指标的最大无作用剂量（以mg/kg计）：（1）小于或等于人的可能接触剂量的100倍者，表示毒性较强，不必进一步试验。（2）大于100倍而小于300倍者，可进行慢性毒性试验。（3）大于或等于300倍者。不必进行慢性试验即可进行评价。6、结果判定第四阶段慢性毒性试验1、概念

观察试验动物长期摄入受试物质所产生的毒性作用。2、目的发现只有长期接触受试物后才能出现的毒性作用确定最大无作用剂量，对最终评价受试物能否应用提供依据。3、实验剂量：一般至少设2个剂量组，其中高剂量组应使动物引起阳性反应，但剂量又不能太高，否则动物死亡太多。低剂量组应在整个试验期间不出现任何有害作用。有条件时可设3～4个剂量组，可以LD50的1/10，1/50，1/100，和1/1000设组。世界卫生组织将3个月以内的毒性试验称为短期毒性试验，相当于上述亚急性毒性试验；3～6个月的毒性试验称为长期毒性试验；更长期的观察动物终生者称为终生毒性试验，例如用大鼠试验两年，相当于慢性毒性试验。第四阶段慢性毒性试验4、实验项目：将两年慢性毒性试验和致癌试验结合在一个动物试验中进行，一般选用两种性别的大鼠和/或小鼠。

5、结果判定：如慢性毒性试验所得的最大无作用剂量（以mg/kg计）：小于或等于人的可能接触量的50倍者，表示毒性较强，不必再进行研究。大于50倍而小于100倍者，需要由有关专家共同评议。大于或等于100倍时，可考