植物生理与分子生物学：雄性发育的分子遗传和进化生物学研究

雄性发育的分子遗传和进化生物学研究内容1.花药早期发育中的受体蛋白激酶

和转录调控网络的重要作用

2.减数分裂中同源重组关键基因的

分子遗传分析和相关基因家族的

分子进化研究植物的雄性发育对产量有显著影响

Plantmaledevelopmentgreatlyimpactyield正常雄性育性依赖花药的正常形成和发育研究花药发育的调控机制可以帮助对农作物雄性育性的认识，有助于提高农作物产量正常的花药发育决定了水稻的产量Normalantherdevelopmentcontrolriceyield小麦育种专家—李振声院士杂交水稻之父—袁隆平院士雄性不育体系是杂交育种的重要材料

Malesterilelinesarekeymaterialsforhybridcrops常用雄性不育材料多为胞质型不育，需要“恢复系”核基因不育体系可成为诱导型材料，是“两系”杂交系统的基础认识花药发育有助于新的不育体系的建立花药早期发育决定了雄性育性是否正常

Antherearlydevelopmentcrucialfornormalmalefertility花药正常细胞分裂和分化决定了花粉的形成、数量和质量花药细胞的分裂和分化是雄性育性的核心之一农作物和模式植物花药的结构和已知基因功能非常相似内皮中层绒毡层花粉

母细胞药室表皮模式植物拟南芥是研究花药发育的优良体系

Arabidopsisisanexcellentmodelsystem

forstudyingantherdevelopment植物花药早期发育的关键环节

Keystagesofearlyantherdevelopment细胞分裂Celldivision花药发育的关键环节为三轮体细胞分裂和生殖细胞的分裂，四种体细胞的分化，和生殖细胞的形成细胞分化Celldifferentiation表皮内皮中层绒毡层花粉母细胞体细胞Stage5Stage6减数分裂时期的花药细胞AntherCellsattheMeioticStageSandersetal.,1999Sex.PlantReprod.Stage7Stage9花粉发育时期的花药细胞AntherCellsDuringPollenDevelopmentSandersetal.,1999Sex.PlantReprod.花药早期发育的调控Controlofearlystepsofantherdevelopment花药中的药室的数量是怎么控制的？Howisthe4-lobedpatterncontrolled?ER/ERL1/2调节雄性育性

ER/ERL1/2regulatemalefertility

ER,ERL1,ERL2受体蛋白激酶具有多个功能,包括控制植株高度、果实发育等er,erl1,erl2

单突变的育性正常三种双突变的育性也是正常的ererl1erl2三突变则几乎完全不育ER/ERL调节花药药室的形成

ER/ERL

regulateantherlobeformation

ererl1ererl2erl1erl2erl1erl2/+ererl1erl2(HordandSunetal.,2008)ererl

突变体的花药药室中的缺陷

AntherlobedefectsinererlflowersWild-typeererl1erl2ererl1erl2(HordandSunetal.,2008)ER/ERL在药室形成过程中具有重要作用

ER/ERLplayimportantrolesinlobeformation

MPK3/6在雌雄育性中起着重要作用MAP蛋白激酶

MPK3和

MPK6调控植物抗病反应、胚胎发育、保卫细胞分化等mpk3

突变体

有正常的育性mpk6-1

突变体育性下降mpk3/+mpk6-1/-

突变体几乎完全不育MPK3/6

影响雄蕊发育mpk3mpk6-1mpk3/+mpk6-1/-Wild-type(HordandSunetal.,2008)mpk

突变体的花药药室不正常

Wild-typempk3/+mpk6-1/-(HordandSunetal.,2008)正常花药发育是否需要

细胞间的联系？Iscell-cellcommunicationneededforproperantherdevelopment?药室细胞层形成中的问题细胞间相互作用的机制是什么？Whatisthemechanismofinteraction?SPL是产生造胞细胞和绒毡层所必须的

SPLisrequiredfortheformationofsporogenousandtapetalcellsYangetal.,1999花药细胞分化是受BAM1和BAM2受体蛋白激酶调控的BAM1BAM2receptor-likekinasesarerequiredforanthercellfatesstage5bam1bam2WTstage4Hordetal.2006,PlantCellWTbam1bam2bam1bam2突变体表达减数分裂基因过广SDSRAD51Hordetal.2006bam1bam2

花药表皮下

即是减数分裂细胞Wild-typebam1bam2Hordetal.2006关于BAM1BAM2的小结1.TheBAM1BAM2

控制表皮下体细胞的形成2.PMC是花药中源于L2的细胞的默认细胞种类3.BAM1和

BAM2是受体蛋白激酶,暗示它们介道细胞间信号传导4.SPL

的表达受到BAM1和BAM2限制5.SPL

则促进

BAM1

和

BAM2

的表达BAM1/BAM2和CLV1进化关系BAM1BAM2BAM3CLV1控制花药细胞分化的一个模型Stage6Ems1是绒毡层形成所必须的Stage5Wildtypeems1Zhaoetal.,2002ems1花药细胞的减数分裂Wildtypeems1Zhaoetal.,2002ems1花药中分子标记的性状Wildtypeems1SDSATA7Zhaoetal.,2002LEUCINERICHREPEATSKINASEDOMAINTRANSMEMBRANEDOMAINEMS1

编码一个受体蛋白激酶在洋葱表皮细胞中瞬间表达说明EMS1分布在细胞表面。纯化的激酶区域具有激酶活性。

Zhaoetal.,2002关于

EMS1的小结1.EMS1

控制绒毡层的形成

2.减数分裂中的细胞核分裂不需要绒毡层

3.EMS1表达的时空模式是和绒毡层的形成密切相关的4.EMS1是一个受体蛋白激酶，很可能调节信号传导TPD1可能是EMS1的配体Yangetal.,2003tpd1突变体缺失绒毡层TPD1在减数分裂

中特异表达Microsporocytes(Ms)ParietalCell(SPC)SporogenousCell(PSC)PrimaryPrimaryParietalCell(PPC)SecondarySecondaryParietalCell(SPC)Stage4ESPCPSCEndothecium(En)MiddleLayer(ML)Tapetum(T)Stage5EEnMLTMsTPD1+EMS/EXS+SERK1/2胞间信号传导对绒毡层形成控制Canalesetal.

2002.Curr.Biol.;Zhaoetal.,2002.G&D;Yangetal.2003PlantCell;

Albrechtetal.,2005.PlantCell;Colcombet

etal.,2005.PlantCellEMS1/EXS

和BRI1在序列上很相似EMS1BRI1SERK1/2和

SERK3/BAK1

在进化上很接近控制花药发育的受体蛋白激酶和其他蛋白1.ER/ERL1/ERL2受体蛋白激酶调节花药发育过程中药室的形成

和细胞分化

(HordandSunetal.,2008).3.BAM1/BAM2受体蛋白激酶和SPL转录因子控制花药中体细胞与生殖细胞的平衡

(Hordetal.,2006).2.MPK3和

MPK6MAP激酶

调控

花药早期细胞分裂与分化

(HordandSunetal.,2008).5.TheSERK/SERK2受体蛋白激酶也是绒毡层的形成所必须的，可能与EMS1形成复合受体

(Albrechtetal.,2005;Colcombet

etal.,2005).

4.EMS1受体蛋白激酶是绒毡层的形成所必须的

(Zhaoetal.,2002);TPD1很可能是

EMS1配体

(Yangetal.2003,2005).控制花药早期发育的一个模型L1L2L3Stage1EArStage2ER/ERLMPK3/6Stage4EL1L2L3ArchesporialCell(Ar)MeiocytesSPCSporogenous

CellPPCSPCEnMLTapetumStage5EEnMLTMsSPCPSCTPD1-EMS1

-SERK1/2SPLBAM1/2结论

细胞间的信号传导在花药早期过程中具有重要作用造孢细胞是花药中L2层的默认(default)的细胞种类体细胞的分化需要胞外的信号减数分裂的细胞分裂需要正常的绒毡层功能造孢细胞和体细胞的平衡受到正负反馈机制的调控新的问题

花药发育过程中信号传导的下游靶标是什么？确定花药中造孢细胞的机制是什么？体细胞分化的胞外信号是什么？绒毡层影响减数分裂细胞分裂是通过何种机制完成的？造孢细胞和体细胞之间的反馈机制有哪些？致谢杨明，刘德华YoshitakaAzumiHiroyasuOnaka赵大中，杨晓辉LauraZahn陈昌斌，倪为民李武兴，王冠芳CareyH.Hord张伟，孙玉金AselaWijeratne肖荣，冯保民权力，林振国陆平利，苏钊周筱凡，韩欣伟鲁迪宏，张立烨马萱，徐海燕胡宜，田东兰UeliGrossniklausSteveClarkKeikoTorii张舒群NaomiAltmanRekaAlbertChrisMakaroff李涛王正加StephanSchuster程祝宽董爱武孔宏智王台杨继科技部、基金委、复旦大学;

NSF,DOE,PennState;

RijkZwaan-theNetherlands

葛晓春林娟王应祥常芳徐荣艳王子楠黄霁月王英程志号郭长奎朱恩高张佰隆金越崔洁石倩王双双尹越尤辰江戚继杨洪星张宁孙小芬陈雅毛王磊黄梅张亮生曾丽萍王海锋丁铭李颀王玲王雅琼谢殊颖刘静孙荏苒王君宾州州立大学复旦大学合作者雄性发育的分子遗传和

进化生物学研究马红

hongma@复旦大学生命科学学院

遗传工程国家重点实验室

植物科学研究所

进化生物学研究中心2012年植物分子生物学暑期班

复旦大学内容1.花药早期发育中的受体蛋白激酶

和转录调控网络的重要作用

转录组研究表明至少有1500个基因在

花药中特异或比在其他器官有显著

较高表达；这些基因是怎么调控的呢?一种方法是遗传：寻找突变体，然后分析表型并克隆相应的基因。怎么才能找到调控花药基因表达的基因呢？另一种方法分子生物学：比如筛选一个重要蛋白的相互作用蛋白。还有转录组测序：了解受调控基因影响的重要基因。我们找到了一个不育的突变体dyt1野生型dyt1dyt1是完全自交不育的，但用正常花粉授粉可以结子，

表明雌性育性正常，而雄性则完全不育dyt1突变体雄性不育，可能是因为花粉发育不正常，也可能是花粉萌发或以后的缺陷。为了确定dyt1突变体雄性不育的原因，需要进一步观察花粉发育。我们用了一种叫Alexander的染色，分析dyt1花粉活性。dyt1突变体没有成熟的花粉我们克隆了DYT1基因，并用功能互补的方法证明这个基因是对的。dyt1突变体为什么没有成熟的雄性花粉呢？回答这个问题需要用切片方式来分析花药的早期发育。观察发现在较晚的花药中，没有看到不成熟的花粉，连小孢子或四分体都没有。正常绒毡层分化需要

DYT1

功能dyt1WTstage5Zhangetal.,2006dyt1花药中减数分裂细胞不能形成小孢子，表明减数分裂需要绒毡层功能DYT1在绒毡层中显著表达Zhangetal.,2006绒毡层减数分裂

细胞DYT1编码一个bHLH家族的转录因子；

所以它很可能调控绒毡层的基因表达。

那么它调节哪些基因的表达呢?为了找到更多受DYT1调控的基因，我们进行了转录组分析，表明有～600个基因在dyt1雄蕊中表达下调，还有～300个基因表达上调绒毡层基因表达需要DYT1功能DYT1调控至少32个编码转录因子的基因表达DYT1调控多种转录因子的基因表达两个调控途径:

DYT1-MYB35/TDF1-AMS-MYB103

DYT1-MS1-MYB99若干已知的转录因子具有控制绒毡层发育的功能AGILog2dytlog2wtLog2dyt-wtAnnotationFunctionAt3g284705.18.5-3.4MYB35Pollenformation,upstreamofAMSandMYB103At2g169106.859.39-2.54AMS,bHLHRegulatethetapetumPCD/Preventprematuremicrosporocytesdegeneration.PlantJ.2003At5g561105.257.04-1.79Myb103Callosedissolution,exinformation.PlantJ.2007At5g521705.016.78-1.77ANL1,Unknown;ANSisinvolvedinsynthesisofanthocyaninsinvacuoleAt5g623205.076.65-1.58Myb99ClosetoMyb103,PlantPhysiol.2007At4g349907.288.74-1.45MYB32phenylpropanoidpathway,compositionofpollenwall,plantJ.2004哪些基因是直接受

DYT1调控的?DYT1能和E盒子在体外结合6×His-DYT1pMS1-Ebox+++++++0.1ug0.2ug0.5ug1ug3ug6ug_BFreeprobe→从随即DNA序列中筛选出

DYT1-结合位点的序列－E盒子ATGMS1E-boxesMS1

是

DYT1的一个靶基因，并带有E-盒子6×His-DYT1pMS1-EboxA++M1+M2C+L+++Freeprobe→_DYT1可以和MS1启动子中的

E-盒子相结合实验表明DYT1可以和启动子在体内相结合

从随机寡基序列筛选

DYT1-结合位点E-box/G-box对称的DYT1-结合位点暗示

DYT1以二聚体结合DNADihongLu,BaominFeng,unpublishedDYT1蛋白是不是个二聚体呢？12978128178207bHLHDYTDYT1有一个bHLH结构域，而这个

家族的其他成员是可以形成二聚体的。但要证明DYT1是个二聚体，还要做实验，比如酵母双杂交是一种常用的方法。-AD-DYT1+AD-DYT1BD-DYT1BD-AMSBD-At1g06170BD-At2g31210BD-At2g31220BD-MYB33还有别的蛋白能和DYT1相互作用吗？候选DTY1-结合蛋白通过酵母双杂交筛选,发现143可能和DYT1结合的蛋白,

包括13个

bHLHs,4个

MYBs,4个

bZIPs,1个

MADSbox蛋白和5个其他类型的转录因子.EngaoZhu,YingxiangWang,unpublished检验体内相互作用的实验在进行中DYT1是怎么和这些蛋白相互作用呢？DYT1的哪些部位

是相互作用需要的？DYT1蛋白的结构与功能会不会是介导蛋白相互作用?DNA结合DYT区域的功能是什么?12978128178207bHLHDYT为了验证这个假说，我们用点突变和酵母双杂的方法来分析DYT1中重要的位点。DYT区域具有二聚化的功能AD-DYT1AD-AMSAD-ATbHLH89AD-ATvHLH91AD-ATbHLH10AD-ATbHLH57AD-ATbHLH35DBDB-DYT1DB-L84DDB-V129DDB-L131DDB-I134DDB-F139DI141DDB-I143DI144DDB-F152DDB-T153DDB-M156DDB-M159DDB-L162DDB-I178DDB-V202DChenjiangYou,FangChang,unpublished12978128178207bHLHDYT我们想知道DYT1的重要位点在三维结构中的位置可是现在还没有它的X光衍射三维结构所以我们用计算方法预测了DYT1可能的三维结构影响蛋白相互作用的突变位置I134DL84DI162DV202DI178DM156DF152DF139DI141DI143DI144D红色表示已知所有相互作用均消失黄色表示一部分相互作用消失L84DL84D影响与DYT1和AT4g01460的相互作用M156D影响与DYT1、AMS等

多个蛋白的相互作用SPLEMS1/TPD1/SERKDYT1MYB33/653bHLHsPCD,MicrosporesMYB35MYB103AMSMS1MYB99ExineformationMYB32Phenylpropanoid,

lignin,flavonoidsetc.?Completion

ofMeiosisCallosemetabolismEnzymeandOtherproteinotherTFs?Others?一个调控花药的转录网络结论和问题

绒毡层的分化与功能受到转录网络的控制

DYT1可能直接调节绒毡层基因的转录，包括

DYT1,M