猴胎脑组织移植的实验研究

猴胎脑组织移植的实验研究【摘要】目的为研究胚胎脑组织移植后的组织生长情况。方法对10只猕猴进行了胎脑组织移植。实验按受体脑损伤的时间分为立即移植组和延迟移植组，移植物为胎脑组织悬液，直接移植至创面。结果术后受体的行为及体温均正常；组织学检查发现，移植后1个月可见受体脑内有部分移植的神经元存活，3个月后发现神经元退行性变，部分神经元消失，6个月后移植部位仅见胶质瘢痕和吞噬细胞浸润，显示排斥反应，其中1只术后4个月仍可见存活的神经元，移植物与受体脑界面有相连的毛细血管，并有突触连接。结论脑组织异体移植仍有严重的排斥反应，立即移植与延迟移植的移植物存活无明显差异。

关键字：大脑皮质移植胚胎猕猴类

【Abstract】ObjectiveTostudythetissuegrowthofembryonicbraingraftsinEmbryonicbraintissuetransplantationwasperformedon10monkeyswhoweredividedintoimmediatetransplantedgroupanddelayedtransplantedgroup.ThegraftswastheembryonictissuehomogenateandtransplantedintotheThebehaviorsandbodytemperatureinthemonkeysaftertransplantationwerenormal.Histologically,itwasfoundthatpartneuronswassurvivalinthehostbrainonemonthaftertransplantation.Threemonthslater,retrogradedegenerationoftheneuronswasfoundandpartneuronsvanished.Sixmonthsaftertransplantation,onlyneurondegenerationscar-tissuecolloidandthephagocyteinfiltrationwereseeninthetransplantarea.However,amonkeywasfoundtohavetheneuronsurvivalandtheconnectionofneurofibrilsbetweenthegraftsandhostcerebralAllotransplantationmighthavesevererejection.Thesurvivalofthetransplantsinimmediatetransplantationanddelayedtransplantationhadnosignificantdifference.

【Keywords】CerebralcortexTransplantationEmbryoCercopithecidae

我们参考Willis［1］的脑移植术及Cotman［2］的脑皮质延迟移植技术，将猴胎脑同侧组织移植到成年猴的大脑皮质下，并应用组织学和行为学观察方法研究了猴胎脑移植物的存活情况。

材料与方法

一、实验动物

健康成年太行山猕猴10只，雄性6只，雌性4只，年龄5～8岁，体重3～7kg，其中孕猴2只，妊娠10～12周。

二、胎脑的提取及组织悬液的制备

将孕猴用氯胺酮mg/kg麻醉，无菌条件下剖腹取出胎猴，立即放入无菌盘内开颅，取出两侧大脑半球，放入0～4℃的生理盐水中，剥去软脑膜及蛛网膜，洗净血液。用薄刀片切取右侧大脑半球的灰质，吸入盛有10ml生理盐水的注射器内，套上8号针头推出，制成1∶1的悬液。以台盼蓝染色计数，要求脑细胞浓度不低于1×1010/ml，活细胞＞80%。移植时用6号针头将悬液注入到受体大脑皮质。

三、胎脑组织的植入

1.受体1组：动物5只，用氯胺酮mg/kg、阿托品mg/kg、地西泮mg/kg复合麻醉，右侧常规开颅，露出右侧大脑半球的额、顶、颞叶脑表面，剪开硬脑膜，将脑皮质切除3mm×4mm×8mm。止血后，在创面内注入脑组织悬液～ml，覆盖止血海绵，同时在创面周边皮质下注射3～4个点，每点注射脑组织悬液ml。检查无出血后，缝合硬脑膜关颅。

2.受体2组：动物5只，按上述方法麻醉开颅后，切除右侧大脑皮质4mm×5mm×8mm，造成一个腔隙，止血后覆盖止血海绵，关颅。8天后重新开颅，取出止血海绵，将胎脑组织悬液～ml注射到腔隙内，覆盖止血海绵，关颅。移植在30分钟内完成。

四、术后观察处理

1.感染与排斥的预防：术后用庆大霉素1×104U/kg肌肉注射7天，泼尼松mg/kg肌肉注射15天。伤口每天涂络合碘1～2次，共涂10天。

2.体温和行为观察：实验室观察1个月。医学论文网

3.组织形态学检查：于移植后1、2、3、4、6个月分别在氯胺酮麻醉下开胸，经主动脉注射多聚甲醛，1小时后开颅取出移植部，放入100g/L的甲醛液内及20g/L的戊二醛液内固定1周后，在移植区做10mm厚的连续额状切面，在移植区中心及周边部取材，经脱水、常规石蜡包埋，做6μm连续切片，行HE、克紫和神经纤维染色，光镜下观察。经20g/L的戊二醛固定的标本，按常规电镜制片Epon-812包埋后，先做半超薄切片，定位后修剪组织块，再做半超薄切片，透射电镜观察。

结果

受体分别于1、2、3、4、6个月时处死，每月份每组各处死1只，进行组织形态学观察。第6个月处死的动物(每组1只)作为最后组织学观察。

一、肉眼观察

移植区硬脑膜增厚，约1～3mm，去除硬脑膜，可见脑表面有一直径15mm的凹陷，内陷2mm，呈浅黄色，随着移植时间的延长，颜色逐渐加深，最后呈亮黄色。

二、组织学观察

移植后1个月，光镜下可见移植区有明显的排斥反应，移植中心簇状分布着神经元，核圆，染色较深，染色质分布均匀，可见少量胞突及尼氏体，其周围有多量的淋巴细胞及浆细胞浸润，并有较多的多核吞噬细胞及中性粒细胞碎片。移植物与受体脑的界面组织间隙水肿，可见新生毛细血管。电镜下可见移植的神经元超微结构基本正常，胞浆内可见较多的粗面内质网、微丝、微管，与周围神经纤维形成突触样结构，双层核膜清晰，核内染色质分布均匀。

移植后2个月，前述排斥反应减轻，移植区内神经元数目减少，胞体模糊，部分核固缩。可见散在淋巴细胞浸润，胶质细胞密度增加。

移植后3个月，光镜下见部分移植区神经元的胞浆呈空泡样变，胞突消失，移植物神经纤维分隔成灶性，界面可见大量毛细血管及胶质增生，形成胶质瘢痕。电镜下见神经元出现类似缺血样的收缩性改变，粗面内质网扩张，核蛋白体脱失，线粒体致密，细胞器聚集，溶酶体增多，核内染色质断裂解体，可见神经吞噬现象。

移植后4个月，移植区内找不到神经元，只残留一些小的空腔，周围绕以大量胶质细胞，其中1只胎脑组织移植给自身母亲脑内的受体，仍可见部分存活的移植神经元，与受体脑界面有大量新生毛细血管相连接，周围反应不明显。电镜下见此例移植神经元的超微结构尚正常，粗面内质网、微丝、微血管清晰可辨，与周边神经纤维有突触连接。也就是说这些神经元是存活的。

移植后6个月，移植区内有大量胶质细胞、纤维组织及薄壁血管增生，形成典型的胶质瘢痕。

三、体温及行为观察

受体行为正常，测量体温8天，结果与术前无明显差异。

讨论

一、胎脑组织的植入时机

我们对Willis［1］的大鼠胎脑组织皮质植入法及胎脑组织大脑皮质延迟植入法［2］进行对比研究，结果说明2个组移植物的存活无明显差异。康复安等［3］曾报道猴胎中脑黑质移植给帕金森病模型，术后观察6个月，组织学检查未发现存活的移植物。

二、胎脑组织移植治疗疾病的机理探讨

本组实验结果表明，移植1个月后移植区内可见有部分神经元存活，电镜下显示细胞器正常。随着移植时间的延长，神经元逐渐变性、消失，6个月后仅见留下一胶质瘢痕，但移植区的血管则增生再建良好。多篇报道均提示胎脑移植确实能够改善神经功能，但其机理尚不清楚。神经功能的改善可能是通过其它途径实现的，或是移植区的一系列生物学反应，激活了某种神经生长因子，或刺激了某种神经递质的释放，从而改善了神经功能［4］。

有人发现脑移植后能促进受体的脑细胞和神经元内生长相关的蛋白GAP-43的含量增加，这为胎脑移植促进脑损伤修复提供了新的理论依据。文献报道，神经胶质细胞或吞噬细胞能够分泌神经生长因子，有人还发现手术创伤本身也可能刺激某些介质释放，从而使病情得到改善。上述机理与神经元的存活无直接关系。

三、脑移植的排斥反应问题

早期的观点认为，中枢神经系统是一个免疫特惠区，有利于移植物的存活和免遭排斥。本组实验表明，脑组织移植物存在明显的排斥反应，在移植后1个月时，移植区除有部分正常神经元外，同时还有大量的淋巴细胞、浆细胞浸润，并有较多的多核吞噬细胞及中性粒细胞碎片。随着移植时间的延长，上述免疫反应逐渐消失，代之以大量的胶质细胞增生，最后形成胶质瘢痕。因啮齿类动物基因差异小，故排斥不明显，且神经元易存活。而属灵长类的猴及人类，其个体差异大，排斥反应必定明显。但本组有1只动物移植后4个月，移植区仍有存活的神经元，并有与受体脑界面相连接的大量新生毛细血管，而胶质细胞增生不明显，无明显排斥反应，这可能是由于供体与受体的组织相容性好及受体免疫能力较低有关。由于术前未做组织配型，还有待今后探讨。

本课题为河南省自然科学基金资助项目

参考文献

[1]WillisRA.Experimentsonintracerebralimplantationofembryotissuesinrats.ProcRoyadSocLond，1935,117:400-412.

CotmanCW,eds.Neuronalplasticityistedition.