五氯酚钠对小鼠细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞功能的影响

五氯酚钠对小鼠细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞功能的影响

氯仿钠（也称为三氟氰胺）是世界上广泛使用的农药。由于大面积的普及，它导致了一定的环境破坏，损害了人类的健康。Lang等利用人淋巴细胞在体外接触五氯酚研究中发现,无论工业品还是分析纯五氯酚在10~40μmol/L浓度下与淋巴细胞共同孵育8d,对于IgG和IgM抗体的产生量均有明显的抑制作用。Daniel等在人群研究中发现,血液中五氯酚浓度的升高能够导致T细胞功能障碍。体外研究表明,5mg/L以上的五氯酚能够抑制克鲤鱼和港湾鱼的巨噬细胞和嗜酸性细胞杀菌活性。目前的研究基本上以五氯酚为主,尽管五氯酚钠与五氯酚的代谢途径类似,但其毒性表现是否一致仍需要进一步探索。本研究采用五氯酚钠一次性染毒小鼠,观察染毒后不同时间小鼠免疫功能的变化。1材料和方法1.1动物合格号清洁级ICR雌性小鼠150只(北京大学医学部实验运动科学部);体重20~24g,雌性,动物合格证号:SCXK(京)2002-0001。动物饲养室温,20~25℃,动物进食标准基础饲料,自由饮用自来水。1.2lorophente,四甲基偶氮噻唑蓝mtt五氯酚钠(国产,分析纯,sodiumpentachlorophenate);四甲基偶氮噻唑蓝(MTT),刀豆蛋白A(ConA),脂多糖(LPS,美国Sigma公司);RPMI1640完全培养液,Hanks液等。1.3各组小鼠血清压力和流量比较将小鼠随机分为4组,每组5只。分别为对照组(蒸馏水),25,50和100mg/kg组。将五氯酚钠一次性以灌胃方式染毒,分别在小鼠染毒后3,24和48h,处死小鼠,取出脏器,剔除结缔组织和脂肪,吸净残留血液,称重,进行各项指标测定。1.4mtt法检测细胞管相关酶活性处死小鼠,无菌取脾,制备成单个细胞悬液,然后将细胞数调整至2×106个/ml。将每份细胞悬液分2孔加入24孔板,每孔1ml,其中一孔作为对照,另一孔加入20μlConA(400μg/ml)做为刺激孔,将细胞放入5%CO2,37℃培养箱中孵育68h,取出加入MTT(5mg/kg)50μl/孔,继续培养4h,弃上清,每孔加入1ml酸性异丙醇,吹打均匀,在酶标仪上570nm波长下比色。1.5淋巴结移植方法同T淋巴细胞增值,所用刺激物为25μlLPS(400μg/ml)。1.6中性红的制备处死小鼠后将RPMI1640完全培养液2ml,注入小鼠腹腔,收集灌洗的液体,调整细胞数至5×104个/ml,将细胞悬液加入96孔培养板,每孔100μl。将巨噬细胞置入5%CO2,37℃培养箱中孵育2h,取出后弃上清,加入用RPMI1640完全培养液稀释的中性红(50μg/ml)100μl,再置于5%CO2,37℃培养箱中孵育30min,取出96孔板,弃上清,每孔加入150μl冲洗液,冲洗后弃去。再加入100μl溶解液,在721分光光度计上540nm波长下比色。1.7重组材料lg-4-特征溶液rpmi字巨细胞收集同巨噬细胞吞噬功能测定,收集细胞后,将细胞调整至1×106个/ml,加入24孔培养板,每孔1ml,放入5%CO2,37℃培养箱中孵育2h,取出后弃上清,每孔重新加入1mlRPMI1640完全培养液,同时加入LPS(终浓度5μg/ml),继续培养24h,收集培养上清,用1ml培养上清与1mlGreiss试剂混匀,于540nm波长下比色。同时用亚硝酸钠配制标准曲线,计算培养上清中亚硝酸盐氮含量。1.8统计分析采用SPSS统计软件进行单因素方差分析。2结果2.1对小鼠脏器和脏器的相对重量影响2.1.1不同剂量的五氯酚钠一次染毒3h对小鼠器官变化的影响(表1)一次染毒3h后,100mg/kg五氯酚钠剂量组小鼠的脾脏和胸腺相对重量明显降低,与对照组比较差异有统计学意义,而肝脏和肾脏相对重量与对照组比较差异无统计学意义。50和25mg/kg五氯酚钠剂量组小鼠脾脏、胸腺、肾脏和肝脏的相对重量与对照组比较差异无统计学意义。2.1.2不同剂量染毒24h后小鼠器官变化25,50和100mg/kg五氯酚钠一次给予小鼠24h后,小鼠的脾脏、胸腺、肝脏和肾脏的相对重要与对照组比较,差异无统计学意义。2.2五氯酚钠中毒对大鼠免疫功能的影响2.2.1五氯酚钠对大鼠t淋巴细胞的克隆影响25,50和100mg/kg五氯酚钠染毒小鼠3,24和48h后,小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力均未受到影响。2.2.2小鼠骨髓增殖能力检测25mg/kg剂量组染毒3h后,小鼠B淋巴细胞增殖能力受到抑制,抑制率为46%,随着时间延长,染毒后24和48h时这种抑制效应消失。50mg/kg剂量组染毒3h,也可见小鼠B淋巴细胞增殖能力受到抑制,抑制率为46%,随着时间延长,至染毒后24h,这种抑制效应依然存在,抑制程度减弱,抑制率为35%,进一步观察染毒后48h这种抑制效应消失。100mg/kg剂量组染毒3和24h,小鼠B淋巴细胞的增殖能力均受到抑制,抑制率分别为38%和40%,随着时间延长到染毒后48h,抑制效应消失。2.2.3小鼠体内监督的时间点本研究发现,不同剂量五氯酚钠染毒组在3,24和48h时间点,只有100mg/kg组染毒3h后,小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能受到抑制,而其他时间点和剂量均未见小鼠腹腔巨噬细胞吞功能受到抑制。2.2.4氯酚钠对细胞生成no的抑制作用由试验结果可见,在染毒所用的3个剂量中,只有100mg/kg五氯酚钠在给药3h后抑制了巨噬细胞分泌NO的能力,使得培养液中亚硝酸盐氮含量减少,其他时间点和剂量均未观察到巨噬细胞生成NO的能力受损。3氯酚钠tch1000mg/kg五氯酚钠一次给小鼠3h后,脾脏和胸腺重量明显降低,小鼠的B淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬及巨噬细胞分泌NO均受到抑制,表明五氯酚钠对免疫系统有抑制作用。而T淋巴细胞增殖未受影响,提示五氯酚钠对免疫系统产生有害作用时,有一定的选择性。五氯酚钠给药3h后,巨噬细胞100mg/kg组出现功能抑制,而脾脏B淋巴细胞增殖有25和50mg/kg就出现抑制,表明B淋巴细胞对五氯酚钠毒性敏感。五氯酚在哺乳动物细胞色素P450微料体混合功能氧化酶参与代谢,转化形成四氯氢醌(TCHQ)和四氯儿茶酚(C14CAT)。四氯氢醌对免疫细胞有损伤作用,但是五氯酚在体内转化成四氯氢醌需要一定的时间。五氯酚(PC)在肝组织中经过代谢,产生的未结合四氯氢醌于摄入PCP后4h达到高峰,其后下降排出,则达到脏器(脾脏,腹腔)的时间必然还要延迟。给予B6C3F雄性小鼠300mg/