花粉的生物学特性

花粉的生物学特性

为了在农业和林业的传统育种工作中进行人工辅助授粉和混合授粉，通常需要收集和储存花粉。尤其是在杂交育种工作中,为解决亲本花期不一致和远距离杂交的问题,更需要保存生活的花粉。不同类群植物花粉在自然条件下的寿命,花粉的储藏条件,以及花粉生活力的测定有所区别,这些差异对于研究花粉_柱头的相互作用,作物改良与育种操作,基因库的保持,不亲和性与受精关系,生理调节对花粉萌发的影响和基因流等,均有非常重要的实践意义。1收集和保存花粉1.1温度对药粉散粉量的影响采集花粉常常受到每种植物花粉的产量、散粉特点及外界环境条件等因素的限制,同时各物种间花粉采集的难易程度也有明显的差别。例如,同是生长在北京地区的松树和苹果,在盛花期间一个劳动力可采集到200克松花粉,而花费同样的劳动力却只能采到0.2克的苹果花粉(刘武林,1985)。另外,环境条件中的温度对花药开裂的时间也影响很大,如在散粉期的前后,若气温偏高,花药则会提前开裂。所以花粉采集者应注意散粉临近期气温变化情况。对大多数植物而言,它们的最大散粉量通常发生在上午。采集花粉时还要根据花序发育的形态及其色泽变化的特点,及时将采摘到的花药,放在筛状容器中通风干燥,待花药开裂后,即可筛出散落的花粉。对产粉量较少的植物,可直接采摘未开放的花朵,晾干后摘取其花药,置于塑料容器中摇晃或过筛,使花粉粒因静电吸附作用而附着在容器壁上,然后将吸附的花粉刮拨下来保存。另外,也可直接剪取花枝培养于室内,在人工控制的条件下,如提高室温、增强或延长光照等,以加速花粉成熟,提早采粉时间。一般在室温27℃,用600瓦白炽灯在距离1米远处,每天光照20h,松属(Pinus)和云杉属(Picea)植物的散粉时间可分别提前3～4周和8周(刘武林,1985)。1.2花粉保存花粉收集贮藏后,如何保持花粉的生活力是最重要的问题,下面对影响花粉生活力的因素以及花粉的贮藏条件作一简述。(1)湿度对花粉萌发的影响在花粉的贮藏过程中,应尽量保持较低的相对湿度,使其代谢受到抑制,酶的活性减弱,呼吸作用降低,这样便能使花粉维持较长时间的生活力。对花粉贮藏时期所需相对湿度的研究结果表明,相对湿度的高低与花粉的寿命呈负相关关系,如仙人掌(Schlumbergera)的花粉,当相对湿度为23%时,在-18℃温度下,能保持85%左右的萌发率,但当湿度增加到32%～34%时,同样的温度条件下,只能保持大约20%的萌发率(Thomas,2001)。当相对湿度降到6%左右,花粉贮藏寿命常常是随湿度的减低而加长。大多数植物的花粉最适湿度都在60%以下,如西洋梨(Pryuscommunis)花粉贮藏在3℃下,最适湿度为10%～25%,湿度过高或过低均会降低花粉的萌发率。,但最新的研究却发现,有很多物种的花粉在贮藏时的水分含量不能低于40%,否则,花粉的活力就会很快降低,如郁金香(Tulipagesneriana)、君子兰(Cliviaminiata)和梅花草(Parnassiapalustris)等(Nepietal,2001)。禾本科植物花粉的贮藏更不耐干燥,如水稻花粉即使在10℃和85%的相对湿度下,也只能存活24小时。值得注意的是,大多数花粉在贮藏中,都不耐湿度的剧烈变化(刘武林,1985)。(2)玉米花粉的贮藏低温能延长花粉的贮藏期限。实践已经证明,在超低温度(-180℃～-270℃)下,花粉的生活力可以长期保存。对于大多数物种的花粉,若先经干燥再降低温度,则更有利于生活力的保持。但对人参花粉超低温贮藏的研究发现,在超低温贮藏时,其理想的花药水分含量却是32%～26%(Zhangetal,1993)。大多数植物的花粉在-20℃下即可保持其生活力,如白扦(Piceamyeri)花粉贮藏在-20℃条件下,一年后仍有80%的萌发率;但禾本科植物的花粉却不耐低温,如甘蔗花粉只有在刚结冻的温度和100%湿度下最适保存,玉米花粉在低于-17℃以下就不易贮藏(Towill,1981)。但最近的研究表明,如果将分离的玉米精子细胞在-80℃的低温条件下冷冻保存,然后在37℃下迅速解冻,则仍可保持70%的活力(RoeckelandDumas,1993)。(3)花粉的贮藏方法贮藏花粉周围的大气成分,如CO2和O2对其生活力的影响很大。一般情况下,增加CO2浓度,有利于花粉的贮藏,Beny等发现,高浓度的CO2(如800μmol/molair)能缓和由于高温而造成的花粉活力下降(Benyetal,2001),但O2则有相反的作用。如果在容器中充入N2气,也能延长花粉的保存期。花粉在贮藏期间对气压的高低反应很不一致;一般来说,降低气压,尤其降低氧分压可延长花粉的寿命。例如,紫苜蓿花粉在-21℃的真空条件下,贮藏11年之后仍具有一定的生活力。此外,柑橘属(Citrus)和百合属(Lilium)植物的花粉,在真空条件下贮藏效果也较好,但大麦属(Hordeum)、金鱼草属(Antirrhinum)和甘蔗属(Saccharum)植物的花粉在减压条件下就会立刻死亡(HansonandCompbell,1972)。此外,花粉的生活力还会受一些其他因素的影响。比如,最近一个很有趣的发现表明,一种相思树(Acaciaconstricata)的花经蚂蚁接触后,受精率会有很大程度的降低,这是因为这些蚂蚁分泌的某些抗生素可以使花粉降低甚至丧失生活力(Wagner,2000)。Pandey等研究发现,植株在生长过程中,如果铁元素供应不足,那么该植株上的花粉生活力也会下降(PandeyandSharma,2001)。根据花粉生活力的影响因素,花粉的贮藏方法大致可归纳为这样几种:低温干燥法、真空贮藏法、超低温贮藏法和冻干贮藏法等。上述方法各有所长,具体应用时可根据贮藏的目的因地制宜的采用。低温干燥法要求条件不高,一般在家用电冰箱中就可贮藏。花粉收集后放入干燥器中,置于冰箱内在干燥低温下贮存。烟草、百合、苹果、梅以及松属和云杉属等植物的花粉,用这种方法均可获得满意的效果,但随着贮藏时间的推移,其花粉的生活力也会随之下降。利用液氮将花粉贮存在-170℃以下的超低温贮藏法,从理论上讲,这是保存生命物质最好的方法之一,因为生命代谢活动在这种条件下几乎等于零(Heslop_HarrisonandHeslop_Harrison,1970)。目前,应用此方法对西洋梨、杜鹃、马铃薯及番茄等植物的花粉贮藏,都表现出良好的效果(Towill,1981)。冷冻干燥贮藏法的过程是,首先将花粉置于-60℃低温下冰冻,然后在50mm～250mm汞柱下减压,使其中的水分升华干燥,冻干的花粉可在室温下真空贮藏或充氮气后贮藏。需要注意的是,通过冷冻干燥贮存的花粉,在使用前须将其再度回潮,否则会影响花粉的萌发率。然而,禾本科植物的花粉不适于此种贮藏方法。另外,还有一种有机溶剂保存法,即将花粉贮存在有机溶剂中,使用前使有机溶剂完全挥发,留存的花粉则能较好地萌发(岩波洋造,1980)。不过,这种方法尚未得到广泛应用。2关于花粉生活力表述花粉生活力的方法甚多,仅从传粉生态学和花粉生物学角度定义的花粉生活力就有很多种。为了方便起见,现将各种表述方法列表如下(表1),以供参考。花粉所具有的潜在萌发能力,必须在适合的条件下才能实现;即使花粉已经萌发,但它们可能由于与雌性组织之间存在不亲和性而不能完成受精作用。所以在上述各术语中,萌发力(germinability)、受精力(fertility)和受精能力(fertilizationability)比生活力(viability)更为严谨。为此,我们建议:在检测花粉生活力的时候,要根据花粉发育的时期以及研究的目的,选择不同的描述术语。根据Thomson等(1994)的意见,类似“生活力”和“活力”等术语所表达的含义应更严密地加以限定,或者用更具体的术语来代替。除了前面提及的名词外,“柱头萌发力”(stigmaticgerminability)也是一个很好的描述方式,它能很好地体现离体萌发测定与活体萌发测定之间的差异;另外,花粉寿命(pollenlongevity)也是表示花粉在自然状态下的生命期限,但它仅仅表示花粉在其可受性柱头上具有萌发力的时间,比“柱头萌发力”的实用范围更小,所以并不能完全等同。值得注意的是,花粉生活力的丧失是一个连续的过程,并没有一个明显的界限标志。也就是说,在研究花粉生活力的时候,需要确定一个阈值来表示实验结果。Kumar等(1995)曾用“花粉存活时间”描述花粉生活力大于50%的时间段,这种表示方法可以作为一个衡量标准,以代替一些繁杂而不实用的描述,例如“在花粉有活性的时间内花粉的寿命”等(StanleyandLinkskens,1974)。3测定花粉生活能力的测定3.1花粉生活力的测定花粉生活力的测定方法,通常可分为萌发测定和不萌发测定两种,其测定原理则基于以下五个方面:(1)测定花粉的呼吸作用或其沥出液的化学电导率,这种方法一般很少用;(2)根据胞质的有无,以及酶活情况进行的染色测定;(3)萌发测定,包括离体萌发和活体萌发;(4)根据脯氨酸含量的差异进行测定;(5)以形成有效种子的能力为基准进行测定;(6)用无机酸刺激花粉形成“瞬时花粉管”,根据此现象判断花粉生活力(Gelderenetal,1994)。关于测定花粉生活力的一些经典方法的具体操作过程,其中包括离体萌发测定时各种培养基的配制,悬滴法、穴滴法及膜试法所用装置,以及染色法的具体步骤等,胡适宜等(1993)已作了详细介绍。在此,我们仅就最为常用和较为新近的测定方法加以阐述。3.1.1红色花粉的测定(1)取少数花粉置于载玻片上,加1～2滴TTC溶液,盖上盖玻片。(2)将制片放置35℃恒温箱中15min,然后在低倍镜下观察。凡是染成红色的花粉,其生活力为强,淡红的次之,无色的为不具活力的花粉或不育花粉。(3)观察2～3个制片,每片取5个视野,统计100粒,然后计算花粉的活力百分率。3.1.2荧光反应ss1(1)母液1(SS1)的配制:1.75mol/L蔗糖,3.32mmol/L硼酸,3.05mmol/L硝酸钙,3.33mmol/L硫酸镁,1.98mmol/L硝酸钾,然后蒸馏水定容。另外,为了避免由渗透压引起的花粉管破裂,可以增加蔗糖浓度,若想得到更强的荧光反应还可加大盐的浓度。(2)母液2(SS2)的配制:7.21mmol/L双乙酸荧光素(fluoresceindiacetate)溶于丙酮中,放于4℃冰箱。(3)工作液:取8～12滴SS2于10mlSS1中,混匀直到此混合液变为轻乳状。操作时,取2～3滴工作液于样品上,盖上盖玻片,2min后在荧光显微镜(BP450～490,RKP510,LP520)下观察即可。3.1.3无机酸浓度的选择此测定法中首选的无机酸是硝酸,其次是硫酸,而盐酸不适用于此法。根据经验,对于大多数植物的花粉来说,硫酸的浓度以14.4%效果最佳,而19.2%的浓度则会破坏花粉粒,其中以0.8mol/L的硝酸为所选试剂中最理想的试剂。但研究者可先设定一系列浓度梯度来选择最适合于自己所测样品的无机酸浓度。所以,按此法测定花粉生活力,只需配制合适浓度的无机酸溶液即可。3.1.4染液的加标试验(1)染液的配制和保存:把一小管过氧化物酶指示剂(Sigma390_1)和200μl3%的H2O2(30%H2O2和pH7.4的磷酸缓冲液1∶9混合),加入到37℃预热的50ml稀释的Trizmal6.3缓冲液中(用Trizmal6.3浓缩液(sigma90_3C)和去离子水1∶9混合)。染液在冰箱中能保存15～20d,这期间若发现染液颜色由浅棕色变为深棕色或黑色,说明染液已失效。(2)测定时,取少量37℃预热的染液滴到待测的花粉样品上,10～15分钟后观察,如果花粉变黑,说明花粉具生活力。3.1.5高花粉粒的萌发(1)将待测花粉人工授粉于柱头上,保证花粉与柱头充分接触,并把授粉的柱头与外界隔离以免被污染。(2)一段时间后(以具体物种而定),将柱头取下并小心置于1%的醋酸结晶紫水溶液内。此步骤的目的是使花粉的外壁着上深紫色以易于与浅色的柱头区别开来。(3)用解剖镜(Zeiss,10×)对指定柱头上的花粉粒记数。(4)将该柱头用水漂洗几次后,再对其上剩余的花粉粒记数。根据公式漂洗后花粉粒数目/漂洗前花粉粒数目×100%可得出萌发率。比较而言,此方法最为直接可靠。3.2不同测量法的比较下面我们将测定花粉生活力的方法,其中包括其测定原理,适用范围,方法优缺点的比较等内容汇集在一起,并列表详述如下(表2)。3.3花粉的贮藏及测定为了得到比较准确的测定结果,测定花粉生活力时最好能满足下列要求:1.测定前要详细记录花粉的收集和储藏条件,其中包括温度、水化和脱水情况等;2.测定前应尽量避免野外或