定量分析方法的方法学验证

精密度是指在规定的测试条件下， 同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间接近的程度。精密度是指在规定的测试条件下， 同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间接近的程度。1.精密度的表示方法定量分析方法的方法学验证定量分析方法验证的目的是证明米用的含量测定方法适合于相应分析要求， 在进行定量分析方法学研究或起草药品质量标准时，分析方法需经验证。验证内容有：线性、范围、准确度、精密度（包括重复性和重现性） 、检测限、定量限和耐用性等。一，线性线性是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物质浓度直接呈正比关系的程度。应在规定的范围内测定线性关系。 可用一贮备液经精密稀释，制备一系列供试品的方法进行测定，至少制备五份供试样品；以测得的响应信号对被测物浓度作图， 观察是否呈线性,再用最小二乘法进行线性回归。 必要时，响应信号可经数学转换， 再进行线性回归计算。回归方程的相关系数（r）越接近于1，表明线性关系越好。［用UV法测定时，以对照品配制一定浓度范围的对照品系列溶液，吸光度 A一般在0.3〜0.7，浓度点n=5，用浓度C对A作线性回归，得一直线方程，方程的截距应接近于零，相关系数r应大于0.9999。用HPLC法测定时，以对照品配制一定浓度范围的对照品系列溶液 ，浓度点n=5〜7,用浓度C对峰高h或峰面积A或被测物与内标物的响应值之比进行线性回归或非线性拟合（如HPLC-ELSD,建立方程，方程的截距应趋于零，相关系数 r应大于0.999。线性关系的数据包括相关系数、回归方程和线性图。二，范围范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、 准确度、精密度结果及要求确定。对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其范围应大于被限定含量的区间。三，精确度准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率 （％）表示。准确度应在规定的范围内测试。用于定量测定的分析方法均需做准确度验证。测定方法的准确度可用已知纯度的对照品做加样回收率测定， 即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品， 依法测定。用实测值与供试品中含有量之差， 除以加入对照品量计算回收率。在加样回率收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当， 过小则引起较大的相对误差， 过大则干扰成分相对减少，真实性差。J回收率%=［（C-A）/B］*100%式中，A为供试品所含被测成分量； B为加入对照品量； C为实测值。数据要求在规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价；或设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定， 用9个测定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在 I：1左右，其他两个浓度分别约为供试品含量的80%和120%。应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率（％）计算值，以及回收率（％）的相对标准偏差（RSD）或可信限。四，精密度］

气相色谱法和高效液相色谱法是对同一供试液进行至少五次以上的测定； 精密度一般用相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)表示：RSD=^准偏差/平均值’100%精密度报告的数据应包括平均值、可信限及相对标准偏差。一般在一天之内进行的精密度考察称为日内精密度 (inter-dayvariability);在三天之内进行的精密度考察称为日间精密度 (intra-dayvariability)。有时为了考察随机变动因素对精密度的影响,还需设计进行中间精密度试验， 变动因素包括不同日期、不同分析人员和不同设备。重复性(repeatability)是指在同一条件下对同一批样品， 从样品供试品液制备开始， 制备至少六份以上供试品溶液(即n>6),或设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备 3份供试溶液，进行测定，计算其含量的平均值和相对标准偏差 (RSD)。RSD一般应根据样品含量高低、含量测定方法和繁简进行制订，如含量很低一般不大于 5%;如含量较高，则应从严要求。=重现性(reproducibility)是指在不同的实验室由不同分析人员测定结果的精密度。 当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。 如建立药典分析方法时， 通过协同检验得出重现性结果， 协同检验及重现性结果均应记载在起草说明中。 应注意重现性试验样品本身的质量均匀性和储存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果。五，检测限检测限是指试样中被测物质能被检测出的最低浓度或量。 检测限是一种限度检验效能指标，即反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白(本底)值的高低。它无需定量测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。根据所采用的分析方法来确定检测限。当用GC和HPLC法时，可用已知低浓度样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以 S/N=2或S/N=3时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。检测限的报告数据应附图谱，说明测试过程和检测限结果。 J六，定量限定量限是指样品中被测物质能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定准确度和精密度。 常用信噪比法测定定量限。一般以S/N=10时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。七，耐用性「耐用性系指在测定条件有小的变动时， 测定结果不受影响的承受程度， 为使方法用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时， 就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成比例或pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速及检测波长等。气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体，柱温，进样口和检测器温度等。薄层色谱的变动因素有：不同厂牌的薄层板，点样方式及薄层展开时温度及相对湿度的变化等。经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。检出限、测定限与检测限检出限（detectionlimit,limitofdetection）、测定限（determinationlimit,limitofdetermination）与检测限（detectability、是分析化学中常见的名词术语，近年来，国内外一些文献多有论述［1~6］。但目前国内出版物中对三者的定义、使用仍存在一些混乱现象，有时甚至将三者混为一谈，使深入讨论或比较数据产生困难。一、检出限与测定限查"detectionlimit”或"limitofdetection”对应的中文，有"检测极限［7~13］”，"测定范围［14］”，“检测限［15~17］”,“检出（下）限［15］”，“检测下限［15］”，“检出极限［18］”等多种译法；查"determinationlimit”或“limitofdetermination”对应的中文，有“定量下限［10］”，“定量界限［10］”，“定量测定下限［19］”，“测定下限［20］”等译法。实际上，文献［20~25］曾对检出限与测定限的名称、定义展开过讨论。 1991年8月，全国自然科学名词审定委员会公布的《化学名词》［26］规定了检出限（detectionlimit，编号03.0090）与测定限（determinationlimit，编号03.0091），并得到认可［12，13，27~29］。国际纯粹与应用化学联合会（ IUPAC）1997年通过，1998年发表的《分析术语纲要》（IUPACCompendiumofAnalyticalNomenclature）［30］中规定：“检出限以浓度（或质量）表示，是指由特定的分析步骤能够合理地检测出的最小分析信号 xL求得的最低浓度cL（或质量qL）”。表达式为：（1）式中为空白平均值，空白指与待测样品组成完全一致但不含待测组分的样品； 为空白标准偏差。IUPAC规定与应通过实验以足够多的测定次数求出，譬如说20次。S（灵敏度sensitivity、为分析校准曲线在低浓度范围内的斜率。 k为根据所需的置信度选定的常数，IUPAC规定［30］离子选择电极的检出限（8.3.2.1、可从校正曲线上求得，即曲线两段直线部分切线的交点所对应的被测离子的活度（或浓度）;IUPAC建议IUPAC规定［30］离子选择电极的检出限（8.3.2.1、可从校正曲线上求得，即曲线两段直线部分切线的交点所对应的被测离子的活度（或浓度）;IUPAC建议［30］以信噪比2:1来确定质谱仪器的检出限（12.4.1）;IUPAC规定［30］检出限还可称之为最小可测浓度或量(minimumdetectableconcentrationoramount，2.4)，最小可测值(minimumdetectablevalue，18.4.3.7、等。由于与均基于有限次的测定，因此实际上 3sd通常对应的置信度约为90%。测定限［23，28,29,31,32］是定量分析方法实际可能测定的某组分的下限。 与检出限不同，测定限不仅受到测定噪声限制， 而且还受到空白背景绝对水平的限制， 只有当分析信号比噪声和空白背景大到一定程度时才能可靠地分辨与检测出来。 噪声和空白背景越高， 实际能测定的浓度就越高，说明高的噪声和空白背景值会使测定限变坏。检出限是指产生一个能可靠地被检出的分析信号所需要的某元素的最小浓度或含量， 而测定限则是指定量分析实际可以达到的极限。 因为当元素在试样中的含量相当于方法的检出限时，虽然能可靠地检测其分析信号，证明该元素在试样中确实存在，但定量测定的误差可能非常［大，测量的结果仅具有定性分析的价值。测定限在数值上总应高于检出限。但在IUPAC1997年通过的《分析术语纲要》［30］中，测定限（determinationlimit，limitofdetermination）改称为定量限（quantificationlimit,18.4.3.7 ）或最小定量值（minimumquantifiablevalue，18.4.3.7）。二、检测限虽然全国自然科学名词审定委员会公布的 《化学名词》［26］中并未规定“检测限（detectability、”一词，但实际上该词也在广泛的应用 ［11~13，15，16，29，33~35］。1997年通过的《分析术语纲要》［30］没有单独定义“detectability”，但有“minimumdetectability”（9.244），其定

义为流动相中样品组分在检测器上产生两倍基线噪声信号时相当的浓度或质量流量，即（2）式中D为最小检测限；N为噪声；S为灵敏度。此定义与文献［16,33~35］中“检测限”、文献［29］中“检测器检测限”的定义几乎完全相冋，可视作冋一概念。而比较式（1）、式（2）可知，式（1）中k=2时即得到式（2）,可见，IUPAC规定的“minimumdetectability”实际上是“检出限”的另外一种提法。三、讨论检出限一般有仪器检出限、 分析方法检出限之分。仪器检出限是指分析仪器能检出与噪音相区别的小信号的能力，而方法检出限不但与仪器噪音有关， 而且还决定于方法全部流程的各个环节，如取样，分离富集，测定条件优化等 ［39］，即分析者、环境、样品性质等对检出限也均有影响［20］，实际工作中应说明获得检出限的具体条件。检出限过去也称为检出极限，检测限，测定极限，波动浓度极限等，建议统一称检出限，以其简短且较直观［21］。文献［9~13,36］中检测极限、文献［16,17,33~35,37,38］中检测限、文献［29］中检测器检测限实际上都是检出限。为避免引起混淆或歧义，笔者建议，应遵照全国自然科学名词审定委员会公布的《化学名词》的规定 ，逐步用检出限代替检测极限、检测限、检测器检测限等称谓，作为过渡，确有必要使用检测极限等称谓时应列出其计算方法。按IUPAC1997年通过的规定，“测定限”改称为“定量限”或“最小定量值” ，笔者建议今后应推广使用“定量限”一词，以便与国际结轨。需要指出的是，目前很多国际组织（机构），如国际临床化学联合会(internationalfeder