当归对宫内缺氧新生大鼠神经干细胞增殖的影响

当归对宫内缺氧新生大鼠神经干细胞增殖的影响【摘要】目的探讨宫内缺氧对新生大鼠神经干细胞增殖的影响及当归注射液的保护作用。方法将孕期14d的SD大鼠随机分为对照组、缺氧组和当归治疗组。缺氧组孕鼠自孕第14天开始每天一次经尾静脉注射生理盐水8ml/kg，后用低张性缺氧模型致胚鼠宫内缺氧2h；当归治疗组用250g/L的当归注射液代替生理盐水，其余处理同缺氧组；对照组不缺氧，其余同缺氧组。孕鼠分娩后立即取新生鼠大脑组织，常规石蜡切片，经巢蛋白免疫组织化学染色后行图像分析。结果缺氧组新生鼠海马巢蛋白免疫组化阳性细胞的积分光密度值较对照组增加［IOD缺氧组：；IOD对照组：，P＜］；当归治疗组新生鼠海马巢蛋白免疫组化阳性细胞的IOD值较缺氧组减弱［IOD治疗组：，P＜］。结论一定程度的缺氧可刺激神经干细胞增殖；当归注射液对宫内缺氧新生大鼠神经干细胞可能具有保护作用。

【关键词】当归缺氧神经干细胞增殖

Abstract:ObjectiveTostudytheeffectofintrauterinhypoxiaontheproliferationofneuralstemcells(NSCs)fromnewbornratsandtheprotectiveroleofAngelicainjectiononNSCsinastateofd-conceivingfemaleSDratsweredividedrandomlyintothreegroups:controlgroup(CG),hypoxiagroup(HG)andAngelicagroup(AG)withfiveratsineachthefourteenthdayofpregnanttheratsofHGwereinjectedwithNormalSalinethroughcaudalveins(within7straightdays;8ml/)beforeintrauterinhypotonichypoxia(within3straightdays;onthefourteenth,fifteenthandsixteenthdayafterpregnancy;2hourseveryday).AngelicasinensisinjectioninsteadofNormalSalinewasinjectedintotheratsintheAG,andotherprocedureswerethesameastheadministrationofhypoxiawasperformedinthebraintissuesofnewbomrutswerehamestedimmediatelyofnewbornratsafterexpressionofnestininthehippocampusofnewbornratswasstudiedwithimmunohistochemistryandtheresultswereanalyzedbyimageprocessingofnestinpositivecellsinHGwashigherthanthatoftheCG(IODHG：14806±；IODCG：7387±,P＜)；butinAG,itwaslowerthanthatofHG.ConclusionHypoxiacanstimulatetheproliferationoftheNSCsAngelicainjectioncanplayaprotectiveroleonNSCsfromnewbornratswithintrauterinhypoxia.

Keywords:Angelica；Hypoxia；Stemcell；Proliferation

宫内缺氧是胚胎发育中的常见症，是造成脑瘫、癫痫及智力发育迟缓或智力低下的重要原因，神经系统是胚胎发育中出现最早的系统之一，因此研究宫内缺氧对神经干细胞的影响具有重要意义。目前国内外神经干细胞增殖的研究多是在体外状态下进行的，在体的研究大多集中在对生后7～14d的新生鼠夹闭颈总动脉，给予低氧干预。本实验试图通过建立宫内缺氧模型，观察在体状态下缺氧对新生大鼠神经干细胞增殖的影响，并观察中药当归对缺氧状态的调节，为临床长期观察宫内缺氧对新生鼠的影响和治疗宫内缺氧提供实验和理论依据。

1材料与方法1材料

nestin单克隆一抗购自、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(棕黄色)购自武汉博士德生物工程公司；250g/L的当归注射液购自武汉大学附属第二医院药剂科；OLYMPUSBx-70荧光显微镜成像系统为日本OLYMPUS光学仪器有限公司生产；德国莱卡切片机；三气培养箱，SD大鼠15只由四川泸州医学院动物科提供。2动物配种与分组

将成年发情期SD雌大鼠15只分别与一只雄鼠合笼饲养，次日8：00见阴栓记雌鼠怀孕0d，至孕期14d。孕鼠随机分为对照组、缺氧组和当归治疗组各5只。3动物实验

缺氧组孕鼠自孕第14天开始每天1次经尾静脉注射生理盐水8ml/kg，后用设置好的三气培养箱致胚鼠宫内缺氧2h；当归治疗组用250g/L的当归注射液代替生理盐水，其余处理同缺氧组；对照组不缺氧，其余同缺氧组，孕鼠分娩后立即取新生鼠大脑组织，经40g/L的中性甲醛固定。4石蜡切片与免疫组织化学

每组随机选取20个新生鼠大脑，然后进行常规石蜡包埋，经海马冠状切面切片，切片脱蜡至水，各切片作nestin(1∶200）免疫组化染色(常规链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物法)。5结果分析与判断

用OLYMPUSBx-70荧光显微镜成像系统观察每一切片，每张切片均以海马CA3区为观察目标，200×下照相。胞质染成棕色的就是神经干细胞，每例新生鼠选一张切片，每张切片均选海马CA3区在200×下观察1200个像素线性长度，用Image-ProPlus图像分析软件分析所选线性长度内组织的积分光密度，结果以±s表示。6统计学分析

各组间比较用方差分析，两两比较用LSD法检验。统计处理用软件完成。

2结果

对照组：nestin免疫组化反应阳性细胞质染色棕黄色，细胞稀疏，成一带状分布。缺氧组：nestin免疫组化反应阳性带细胞密集，细胞带两侧即海马皮质和髓质细胞的数量明显增多，其积分光密度值增大，与对照组相比有显着性差异；当归治疗组：nestin免疫组化反应阳性细胞的分布与缺氧组相似，但与缺氧组相比，阳性细胞的染色明显减弱，其积分光密度值减小。见表1。表13组新生鼠海马CA3区nestin阳性细胞积分光密度值(略)

3讨论

神经系统的早期发生是相当复杂的，也是备受人们关注的胚胎学事件。宫内缺氧是胚胎发育中的常见症，而神经系统细胞对缺氧是最为敏感的，因此，宫内缺氧必然影响胚胎神经系统中神经干细胞的增殖、分裂。

目前宫内缺氧的动物模型，比较成功的是Bjelke法［1］，但此法要对孕鼠进行剖腹手术，术前要使用麻醉药物，这对胚鼠可能造成新的影响。为了使实验条件更易控制，本实验在本研究小组前期的宫内缺氧模型［2］的基础上，采用了智能型三气培养箱代替自制的缺氧缸而制成的持续低张性缺氧的动物模型。实验结果发现：缺氧组新生鼠神经干细胞的nestin免疫组化阳性细胞的积分光密度与对照组之间差异有显着性，说明缺氧后神经干细胞的功能发生了改变，提示该宫内缺氧模型是基本成功的。与Bjelke法相比，此宫内缺氧模型不需对孕鼠进行剖腹手术，避免了手术因素的干扰。与本实验组的前期方法相比，避免了氧气、二氧化碳浓度、温度和湿度波动对实验结果的干扰。

影响神经干细胞增殖的因素很多，神经干细胞的增殖受自身基因调控和外来信号调控两种机制的影响［3］，本实验中，观察到缺氧3d组新生大鼠巢蛋白免疫化反应增强、阳性细胞增多，说明缺氧后神经干细胞表达巢蛋白增加。巢蛋白(nestin)是一种仅存在于神经上皮干细胞的中间丝成分，其表达有特定的时序性［4］。在分裂中期，从核膜溶解到胞质分离，其巢蛋白表达明显增加，尤以末期最高。因此，神经干细胞表达巢蛋白的增强，说明神经干细胞进入了分裂期，是细胞在分裂的表现。缺氧后大脑巢蛋白增加表明缺氧可刺激神经干细胞进入增殖状态；神经干细胞在分裂间期，巢蛋白呈卷曲状的长纤维围绕在核周围，巢蛋白形成了笼状结构围绕在染色体周围［5］。本实验结果表明，缺氧刺激了胚胎大鼠大脑中

［1］BjelkB,AnderssonK,OgrenSO,etlesion:proliferationoftyrosinehydroxylase-immunoreactivenervecellbodiesintheratsubstantianigraandfunctionalchangesindopamineneurotransmission［J］.BrainRes，1991;543(1)：1.

［2］余鸿，吴雨岭，程基焱，等.当归注射液对宫内缺氧胎鼠大脑皮质神经元的保护作用［J］.时珍国医国药，2006，17：1144.

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［4］MichalczykK，ZimanM．Nestinstructureandpredictedfunctionincellularcytoskeletalorganisation［J］．Histol，Histopatho1，2005，20：665.

［5］SahlgrenCM,MikhailovA,HellmanJ,etreorganizationoftheintermediatefilamentProteinnestininvolvesphosphorylationbycdc2kinase［J］.JBiolChem，2001，276：16456.

［6］YinYJ，JuR，FengZC．Changesofneurals