分子诊断学：聚合酶链反应及其应用

聚合酶链反应及其应用分子诊断学

易变的外表VS难变的本质

医学：整形江湖：易容术意外：肢体残骸暴力案件：碎尸岁月：成熟、苍老容颜，再到木乃伊

面对外表的千变万化，该如何把握其本质？他（她）是谁？

考古和灾难后的遗骸鉴定

地震、矿难、空难、911、海啸等

*肯航一架客机在从喀麦隆西部城市杜阿拉机场起飞后不久坠毁，机上114人全部遇难；救援人员在喀麦隆坠机现场发现了189个肢体残骸。由于这些残骸破损程度相当严重，加之在水中长时间浸泡导致腐烂，因此只能通过DNA鉴定来判断死者身份

Whoishe?个体识别@我是谁？谁是谁的谁亲权鉴定如何解决上述问题？

分子水平的检测和比对个体（你我他）识别：用各种分子生物学技术，检测确认个体、比对个体间在分子水平上的异同相关的分子生物学技术：

分子杂交，测序，PCR，芯片技术等例如：DNA指纹（DNAfingerprint）原理：即利用DNA多态性，它具有完全的个体特异性，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美（故名）

谁是谁的谁亲权鉴定在大多数的情况下，母、子关系是已知的，要求鉴定假设父和孩子是否具有亲生关系。此时只要对比孩子与假设父的基因型：*如果每一对等位基因中孩子与假设父都出现相同的基因型，则可以认定具有亲子关系。*如果等位基因中孩子与假设父出现２对或２对以上的不匹配的基因型，则可排除假设父与孩子的亲生关系。

个体识别未来的“ID”

分子水平的检测和比对的用途个体（你我他）识别：用各种分子生物学技术，

确认个体、比对个体间在分子水平上的异同分子诊断或基因诊断：通过各种分子生物学技术，检测基因及其表达产物的存在状态，对疾病作出诊断相关的分子生物学技术：

分子杂交，芯片技术，PCR，测序，等本讲内容1PCR概述2PCR原理3PCR产物检测与分析方法4PCR特点及应用范围5PCR技术发展简史（了解）6PCR衍生技术7荧光定量PCR8其它基因扩增检验技术9PCR相关检验的质量管理（了解）1-1基因扩增及其方式

geneamplificationgenemagnification

1PCR（Polymerasechainreaction）概述1-1基因扩增1）定义：指基因拷贝数增加的现象是基因表达增加的一种重要机制

一般说来

正常细胞：特定基因的扩增与其对内外环境因素的应激反应有关病变细胞：基因扩增则是致病因素所致的异常扩增如肿瘤细胞中常见癌基因的扩增

2）方式？？？

2）基因扩增的方式（1）天然扩增机体细胞内的扩增

在各种因素（发育和进化的需要、对环境刺激的应答等）作用下，机体细胞内相关基因的复制扩增（2）人为扩增①分子克隆体外、细胞内②DNA合成仪试管内（无细胞体系）③PCR-试管内（无细胞体系）重组DNA目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取目的DNA分子1）基础研究的需要*医学生命科学研究*农林畜牧鱼业的基础研究

……2）应用研究及应用的需要*医学领域（如基因诊断、法医学检测）*现代生物技术产业（药物开发，疫苗，高质量食品和日常生活用品等）

……1-2PCR技术诞生所依赖的社会需求1-3PCR的定义

动画短片播放1-3PCR的定义模板DNA（templateDNA）引物（primer，一对）耐热DNA聚合酶四种单核苷酸Mg2+PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始1个分子DNA变成2个分子PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束2分子DNA变成4分子DNA

利用DNA聚合酶催化一对引物间的特定DNA片段在体外实现快速、大量扩增的方法也称：无细胞克隆技术或：特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法

是一种模拟体内天然DNA复制过程的体外核酸扩增技术，是基因扩增技术的一次重大革新

1-3PCR定义

现已广泛应用到分子生物学研究、临床检测等各领域。

优点：

特异、敏感、简便自动化快速、高效（数小时内可使模板扩增107～108倍）2-1DNA的变性和复性2-2PCR标准反应体系及反应过程--三步曲2-3反应的结果2-4PCR的反应条件及其对PCR的影响2-5产物片段及其累积过程2PCR原理

2-1DNA的变性与复性DNA的变性（denaturation)

热变性是实验室最常用的方法DNA的复性（renaturation)1）标准反应体系（五要素）

（1）DNA模板：靶基因（2）原料：dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）

（3）催化酶：耐高温的DNA聚合酶（如：Taq酶）（4）一对引物:扩增序列的决定者其与靶基因两侧序列互补（5）Mg2+

和Buffer

2-2PCR标准反应体系及反应过程

高温变性：在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为2条单链DNA模板低温退火：在低温（37～55℃）下，2条人工合成的寡核苷酸引物分别与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链

适温延伸：在耐热DNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以引物的3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链2）反应过程（三步曲）PCR原理示意图SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension

2-2反应过程

重温PCR短片

1）每一条双链DNA模板，在一次热循环后就成了两条双链DNA分子

2）每次循环产生的DNA均能成为下次循环的模板

3）每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物以指数形式（2n）迅速扩增

4）经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上

实际上一般可达106～107倍（why？？？）

2-3PCR的结果

式中：Y

表示扩增产物的量

A表示n-1次扩增时DNA分子数量

E

表示扩增效率

n表示循环次数扩增30个循环，即n=30时若E=100%，则y=230=1073741824(>109)

若E=80%，则y=1.830=45517159.6(>107)

由此可见，其扩增的倍数是巨大的!PCR反应动力学公式：Y=A（1+E）n

2-3PCR的结果

30次循环后靶序列扩增的数量将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭（EB)等染色，在紫外灯照射下可见到DNA的特异扩增区带是一种荧光染料，可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下发出红色荧光根据情况:

1)可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB2)亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15minEB染色后，肉眼可见核酸电泳带的

DNA量一般>5ng

具有高诱变性SYBR-green和

gelred是毒性更小的染料溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)2-4反应条件及其对PCR的影响PCR操作程序①向一微量离心管中依次加入双蒸水、缓冲液、Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板和TaqDNA聚合酶②混匀，离心数秒，使反应成分集于管底③加矿物油50～100μl于表面，防蒸发④置之于PCR仪上，设置程序，行热循环PCR反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）**单、双链均可**几乎不需要纯化**但，需要知道靶基因两侧的核酸序列**一般临床检测标本，可采用快速简便的方法裂解细胞或

病原体，再消化除去染色体的蛋白质以游离靶基因，便可直接用于PCR扩增**以RNA为模板时，要防止RNase降解RNA

注意：不能混有蛋白酶、核酸酶、

DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类

1）模板A

各种微生物B

细胞

血痕、精斑、口腔拭子、阴道拭子、尿样、单根毛发、指甲削刮的碎屑、牙刷、琥珀中的昆虫、木乃伊C

固定/包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化

模板DNA的浓度：

0.1～2ug/100ul体系

*PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高*但，模板DNA浓度过高，则致非特异性产物增加

模板DNA的来源及浓度2）耐热的DNA聚合酶

来自嗜热水生菌，耐热具有5’-3’方向的聚合酶活性

5’-3’外切酶活性逆转录酶活性来源：有提纯产物也有基因工程产品酶量：过多，降低反应的特异性过少，降低反应的产量例：经典的TaqDNA聚合酶的特性

该基因2496bp（832aa），酶蛋白为94KDa

酶催化反应速度与温度的关系

75～80℃：延伸约150nt/酶分子/s70℃:

延伸>60nt/酶分子/s55℃:延伸24nt/酶分子/s温度：过高(90℃以上)

过低(22℃以下)都降低TaqDNA酶活性良好的热稳定性：

PCR混合物中的TaqDNA聚合酶

92.5℃X130min95℃X40min97.5℃X5～6min

其热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件也是PCR技术能迅速发展和广泛应用的重要基础仍可保持50%的活性例：经典的TaqDNA聚合酶的特性忠实性该酶无3’→5’外切活性

SO,该酶无法校正PCR中发生的碱基的错配

即其保真性不如PfuDNA聚合酶等其碱基错配机率：2.1×10-4

例：经典的TaqDNA聚合酶的特性离子依赖性

Taq酶依赖Mg2+，对[Mg2+]非常敏感**[MgCl2]在2.0mmol/L时，TaqDNA聚合酶的活性最高**Mg2+过高：抑制酶活性

[Mg2+]在10mmol/L时可抑制40～50%的酶活性

例：经典的TaqDNA聚合酶的特性TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性，可将PCR双链产物的每一条链的3’端加入单核苷酸尾

即：可在PCR产物的3’端加上突出的单A核苷酸尾再：在仅有dTTP存在时，它可将平端的质粒的3’端加入单核苷酸尾，产生3’端突出的单T核苷酸尾应用该特性，可实现PCR产物的T-A克隆法

1）TthDNA聚合酶：**从ThermusthermophilusHB8中提取而得**该酶在高温和MnCl2条件下，能有效地逆转录RNA**当再加入Mg2+后，该酶的聚合活性大大增加

SO，逆转录为cDNA后，与DNA的扩增可用同一种酶催化

即该酶适用于RT-PCR

除经典的Taq酶外，还陆续发现下列耐热酶

2）pfuDNA聚合酶

是从Pyrococcusfuriosis中精制而成的高保真、耐高温DNA聚合酶不具有5’-3’外切酶活性，但具有3’-5’外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，使产物的错配率极低其催化DNA的忠实性比TaqDNA聚合酶高12倍PCR产物为平端（无3’端突出的单A核苷酸）3）VentDNA聚合酶

*是从Litoralis栖热球菌中分离出的*无5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可以去除错配的碱基，具有校对功能

*可扩增>12kb的模板DNA

对PCR所用的聚合酶的选择原则和参考信息

（自学，了解）TaKaRaPCREnzymes1.TaKaRaTaqTM1）用于1～2kbp以下的DNA片段的PCR扩增2）比较经济的PCR用DNA聚合酶3）适用于一般的PCR扩增或检测2.TaKaRaExTaqTM1）用于15kbp以下的DNA片段的PCR扩增2）融合了LA-PCR技术3）可信度是TaKaRaTaqTM

的3～4倍4）从扩增灵敏度、扩增量、PCR条件的通用性考虑，是一种万能型PCR用DNA聚合酶3.TaKaRaLATaqTM1）用于10kbp以上的DNA片段的PCR扩增2）融合了LAPCR技术3）可信度是TaKaRaTaqTM的7倍4）适于扩增富含GC或复杂二级结构的DNA（用GCBuffer）4.PyrobestTMDNAPolymerase1）高保真性（HighFidelity）：与Pfu、VentDNA聚合酶相同，可信度是TaKaRaTaqTM的10倍以上2）良好的扩增性能：与TaKaRaTaqTM有相同的扩增性能（优于Pfu、VentDNA聚合酶）TaKaRaPCREnzymesTaKaRaPCREnzymes

5.TaKaRaZ-TaqTM1）反应速度快，是TaKaRaTaqTM的5倍2）扩增性能良好，与TaKaRaExTaqTM相同3）可信度高，是TaKaRaTaqTM的3～4倍DNAPolymerase的可信度比较TaKaRaPCR酶的性能比较PCR时酶的选用

引物：与靶基因两侧互补的寡核苷酸，其本质是单链

DNA，它决所得扩增产物的特异性和长度

（1）引物长度：18-40nt,常用20-24nt

**至少18nt,才能保证扩增反应的特异性

**太长，则致退火时引物与模板结合不充分，扩增产物减少

3）引物（primer)及其浓度（2）引物跨度：以200-500bp为宜

特定条件下可扩增长至10kb的片段（3）引物序列：除与靶序列两侧匹配外，还应与核酸数据库的其它序列不匹配(无明显同源性）（4）引物浓度：一般是0.1-0.5mol/L。理想状态是：

以最低引物量满足对产物扩增的最大需要

引物浓度过高：

@@

引起错配等，致反应特异性下降@@

增加引物间二聚体的形成机会，降低扩增效率引物间互补形成引物二聚体引物内互补形成二级结构

引物设计的最大原则

在扩增的特异性和扩增效率上取得平衡即最大限度地提高扩增反应的特异性和效率

引物设计的软件有很多既可以在线设计，如Primer3

/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

也可以用Primer5、Oligo6.65等等

序列应针对靶基因的高度保守区（最特异的区）

同时与非扩增区无同源序列（以减少非特异结合）

引物长度以18-30nt为宜，多为20-24nt

ATGC最好随机分布（避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′-端不应超过3个连续的G或C）

G+C占45-55%

（G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带）两引物之间：匹配的GC含量（why?

）

引物设计原则（1）引物设计原则（2）

引物内部无互补序列，避免形成二级结构两引物间无互补序列，避免形成引物二聚体引物3’端为关键碱基,其第1和2个碱基要严格配对，否则致PCR失败或扩增效率和特异性降低

5’端无严格限制，其碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态，因此可在其外设计附加序列（见后,便于对扩增产物的分析和克隆)，其对PCR反应无明显影响

3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列引入定点突变序列探针标记(让引物中的核苷酸带标记）4）dNTP的质量与浓度（1）dNTP呈颗粒状：保存不当易变性失活（2）dNTP溶液呈酸性：先配成高浓度、小量分装，-20℃冻存（以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5）

多次冻融会使dNTP降解（3）浓度：取决于扩增片段的长度(920-200mol/L)

过高易致碱基错配；过低则降低反应产量（4）四种dNTP浓度应相等任何一种dNTP浓度不同于其它时,容易引起错配

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂*0.5mmol/L2.5mmol/L反应体系*[Mg2+]过低和过高→

↓Taq酶活性和特异性→

↓

PCR产物数量和质量

5）Mg2+6）循环参数的设置

①变性温度与时间通常用93～94℃xlmin

或95℃x20～30sec

若低于93℃，则需延长时间温度过高则降低酶的活性由于初始的模板DNA链比较长，因此PCR的第一个循环所需的变性时间更长（？）&&变性温度低会致解链不完全，

此乃致PCR失败的最主要原因

②退火(复性)温度与时间退火温度与时间：取决于①引物：长度、碱基组成等②靶基因：长度

对于20nt、G+C含量约50%的引物，

55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想退火温度是影响PCR特异性的重要因素

↓温度

↑温度

↑反应的灵敏性↓反应的特异性↑扩增的特异性↓反应的灵敏性

杂交严格度

引物的复性温度和时间

通过以下公式帮助计算和选择合适的温度复性温度=Tm-（5～10℃）Tm=4（G+C）＋2（A+T）

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR的特异性

复性时间：

30～60sec，足以完成引物与模板之间的完全结合③延伸温度与时间TaqDNA聚合酶催化DNA聚合的速度

75～80℃150nt/sec/酶分子

70℃60nt/sec/酶分子

55℃24nt/sec/酶分子

>90℃时，DNA合成几乎不能进行③延伸温度与时间延伸温度：70～75℃

既要考虑其对酶活性的影响

还要考虑引物与模板的结合常用温度：72℃过高：影响酶活性，也不利于引物和模板的结合③延伸温度与时间延伸时间：根据待扩增片段的长度而定<1kb的DNA片段1min3～4kb3～4min10kb15min

延伸时间过长会导致非特异性扩增**对低浓度模板的扩增，延伸时间可适当延长6）循环参数的设置标准反应中采用三温度点法双链DNA在90～95℃变性再迅速冷却至40～60℃退火然后快速升温至70～75℃延伸对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法,即将退火与延伸温度合二为一，多采用94℃变性，65℃左右退火与延伸④循环次数

决定着PCR扩增程度主要取决于模板DNA的浓度和对产物的需求量30次左右**循环次数太多，则扩增效率降低同时，错配和非特异性产物的量也随之增多2-5PCR产物片段及其累积过程1）PCR产物：可分为长产物片段和短产物片段

是由于引物所结合的模板不一样所致短产物片段：长度严格限定在2引物链的5’端之间，是需要扩增的特定片段，以指数形式扩增(2n)长产物片段：比两引物限定区更长的延伸产物，是以原始模板DNA为模板的扩增反应产物，以倍数形式扩增(2*n)动画里可见自学长、短产物片段PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension长片段产物短片段产物在第一个反应周期中，以2条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要与新合成的链（长产物片段）结合；引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就使这次延伸的片段的3’端有了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的短产物片段因此，“短产物片段”是按指数级倍数增加，而长产物片段则以算数倍数增加，几乎可以忽略不计

以一个原始模板为例（1）基准期：一般为1-15个PCR反应周期该阶段PCR产物的增加较缓慢（2）指数增长期：一般为15-25个循环时，该阶段PCR产物的增加最为明显，与循环数呈线性关系2）PCR产物的积累过程：三个时期（3）平台期：一般在25个循环以后，PCR产物的增加又变得很缓慢，同时该期非特异性扩增和错配也明显增多引起平台效应的因素

dNTPs或引物等消耗殆尽

TaqDNA聚合酶活性逐渐降低

PCR产物之间、反应产物与模板之间的杂交

明智之举：选择合理的循环次数，既能得到足够量的PCR产物，又可避免循环次数过多带来的不利

根据扩增目的采取相应的分析方法1）鉴定产物的有无及片段大小：电泳分析2）推测模板的量：如RT-PCR,荧光定量PCR（后详）3）检测基因结构的改变（突变、重排、缺失等）

①DNA测序②杂交分析：S-blot、班点杂交@@@等③PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）④PCR-单链构象多态性（SSCP)⑤变性梯度凝胶电泳（DGGE)—见“其它技术”3扩增产物的检测与分析@@@：其中的等位基因特异性寡核苷酸技术（ASO）1）鉴定产物的有无、多少及片段大小：电泳分析

电泳（琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳）

用已知MW的标准DNA对DNA片段大小的估算

带负电荷的DNA或RNA，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极

根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开

1）MW较小的DNA迁移率高于MW较大的DNA2）MW相同者：构型紧密的比松散型的迁移率要快，例如超螺旋DNA快于开环DNA或线性DNA分子核酸电泳基本原理

*共价闭合环状的超螺旋分子（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）

*开环分子(ocDNA)*线形DNA分子(linearDNA,LDNA)

这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞LDNA＞ocDNADNA分子样品可能有三种构型无缺口的双链环状DNA即超螺旋DNA；DNA两条链中有一条链发生一或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(OpencircularDNA)凝胶电泳的分辨力：与凝胶的类型和密度相关琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50kb之间；聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物；分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖，后者熔点：62～65℃

。熔解后，在37℃

可保持液态数小时；在25℃

可保持液态约10min

PCR-RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism）

基因结构的改变导致其中的酶切位点数目变化（↑或↓），因此酶切产生的片段的长度和数目就随之改变；通过与对照组比较，可推断被分析的目的片段是否有结构改变AG

总长10kb酶切后3和7kbA突变为G，导致新增酶切位点现成对照待测√single-strandconformationpolymorphism该分析适合基因突变的大规模筛查即单链DNA由于碱基序列不同引起的构象差异，可致相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要PCR-SSCP（单链构象多态性）单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使其发生改变空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶（PAGE)中受到的阻力不同，迁移率就不同

因此，通过非变性PAGE，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分开

PCR-SSCP原理

①PCR扩增靶DNA②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子③将适量单链DNA进行非变性PAGE④通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果

与正常对照的相比，若发现单链DNA带迁移率有改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变

其基本过程PCR-SSCP过程据此，该法可检测DNA中单个碱基的变化（替代、插入）或微小的缺失或插入但是，不是每个碱基的改变都会引起单链构象的改变因此，该法不能鉴别所有的突变，其鉴别能力约80%4PCR技术的特点和应用1）高度的灵敏性：基于PCR扩增的高效性

每轮循环，PCR产物增加一倍

30轮循环，扩增量达230个拷贝（109拷贝）*皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(μg=10-6)级*从100万个细胞中检出一个靶细胞*病毒检测的灵敏度可达3个PFU(空斑形成单位）*细菌检测的最小检出率为3个细菌是计量病毒（或噬菌体）的一种单位，但只限于用在有产生空斑能力的病毒原理：用少量有破坏宿主细胞能力的病毒去感染已形成致密单层状态的宿主细胞群体时，经过一定培养时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染崩溃，形成肉眼可见的空斑（噬菌体时可直接观察，病毒时则需借助于活体染色的方法）。在理论上，一个病毒体就可以形成一个空斑，但实际上有不同程度误差，因此不能准确的与其他计量单位互换用PFU计量病毒的方法叫作PFU法

空斑形成单位又称蚀斑形成单位4PCR特点及应用引物引物2）高度的特异性

PCR的特异性决定因素（1）引物与模板DNA特异正确的结合（2）TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性

4PCR特点及应用3）操作简便，自动化一次性建立反应体系，2～4小时完成扩增,再用电泳法检测

试比较：

分子克隆法实现的DNA扩增法（首先要构建含有目的基因的重组体,然后将它导入细胞后进行扩增,再进行筛选鉴定;最后才是通过大量培养细菌来扩增目的基因。要经过DNA酶切、连接、转化和培养等、提取和回收等程序,操作复杂，一般需要2-7天左右4）对标本的纯度要求低：血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA5）重复性好6）用途广泛

（1）医学基因组DNA分析，遗传物质的鉴定和遗传病、肿瘤和感染性疾病等的诊断、治疗和预防（2）农林牧渔业（3）环境科学（4）法医学（5）考古学PCR技术的应用该方法首先被应用于人β-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断自1985年首次报道PCR方法以来，PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病、法医鉴定和考古研究等多领域，并发挥着越来越大的作用九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1997年卫生部下文禁止普通PCR在临床诊断的应用1998年实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测PCR技术的应用举例**DNA重组：目的基因获得和筛选**基因检测

1）病原生物基因检测：感染性疾病（HBV/HCV)2）遗传病的诊断：地中海贫血等

3）恶性肿瘤诊断：癌基因或抑癌基因突变、耐药基因表达水平、标志物基因

4）性别基因鉴定

5）法医学分析：个体识别、亲缘鉴定

表病原微生物检测项目及方法检测的生物基本方法结核分枝杆菌（TB）乙型肝炎病毒（HBV,DNA）丙型肝炎病毒（HCV）人免疫缺陷病毒（HIV）人巨细胞病毒（CMV）人乳头状瘤病毒（HPV）沙眼衣原体（Ct）淋病奈瑟菌

PCR，TMAPCR，bDNAPCR，TMA，bDNAPCR，bDNA，NASBAPCR，HybridCapturePCR，HybridCapturePCR，LCR，TMA，SDAPCR，LCR，HybridCapture

例如

癌基因或抑癌基因突变等程序：PCR-酶切-电泳

PCR-RFLP

正常病人

PCR-RFLP例如基因鉴定待测1待测2Y引物PCR电泳待2男性

待1女性4PCR特点及应用

不足：

1）需靶DNA序列的信息

2）产物短小

3）错配5PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程,便可克隆tRNA基因当时引物合成困难（1982年DNA合成仪问世）1973年重组DNA技术问世，使细胞内克隆基因成为可能故，该设想便被搁浅

胡德（LEHood）实验室的4大发明（ABI）蛋白质测序仪:1977年（ABI)DNA合成仪：1982年（ABI)

1956年美国生物化学家科恩伯格与美国生化学家奥乔亚用人工合成的方法制得了DNA和RNA1970年，印度血统的美籍学者科兰纳首次用化学方法人工合成了有77个核苷酸对的酵母丙氨酸的结构基因DNA测序仪：1986-06(ABI)蛋白质合成仪:20世纪80年代（ABI)

1969年第一台自动多肽合成仪问世第一个产品是核糖核酸酶A(梅里菲尔德）

2003-05第一台中国自制多肽自动合成仪投产

(中国地奥基团-胸腺五肽）

ABI发明四大生物研究设备，并成功实现了产业化，为现在分子生物学的发展打下了坚实的技术基础，对世界生命科学研究和产业发展产生了深远的影响。胡德现任CNSI董事、美国纳斯达克上市公司董事，他还是美国国家科学院(NAS)院士、美国学者协会会员、美国科学艺术学院院士5PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明*1983年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了在试管中模拟细胞内的DNA复制，即聚合酶链反应（PCR），1985年发表相关文章*最初采用大肠杆菌DNA聚合酶的klenow片段进行PCR，该酶不耐热，致该过程耗时、费力、且易出错由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视

1988年才木(Saiki)等从嗜热水生杆菌(Thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶，命名为Taq

DNA聚合酶其用于PCR时，在热变性后不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶，大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，也增加了扩增长度（2.0kb）

Thermusaquaticus

AhotspringinYellowstoneNationalPark

此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为70～75℃。最初从中分离到分子量60～68KDa，比活性为2000～8000U/mg的DNA聚合酶后来，Cetus公司的KaryMullis等又分离到比活为20万U/mg的纯酶，分子量为93910。此种9.4KDa酶的最适温度为75～80℃，与单纯核苷酸的结合率（Kcat）可达150核苷酸（nt）/s酶分子5PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明

TaqDNA聚合酶的问世和应用使PCR可以高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪，使PCR技术得到了广泛应用

**1993年，Mullis等因该项技术分明获诺贝尔化学奖KaryB.Mullis（1944－）PCR技术问世背后的故事在一个春天的夜晚,Mullis与女友驾车于美国加州西岸的128号公路途中有了PCR的灵感Cetus公司以1万$奖励他发展PCR，其后却于1991年转手将专利权以3亿3千5百万$转卖给全球最大的制药厂--瑞士offman-LaRoche公司，而使得PCR这个技术成为史上最贵的专利瑞士这家公司现在正以连锁反应般的速率赚进美金此后，PCR的应用一日千里，相关的论文发表量令其他研究难望其项背PCR对于基础及临床医学的贡献之深远，也难以估量

有时候一个创造性的灵感在你不经意中突然浮现出来

在1983年4月的一个星期五的晚上，我和一个化学家朋友正在驱车去Mendocino县的路上，她睡着了，美国10l国道也没有驾车要求。我喜欢晚上驾车，每个周末我都要去我北部的小木屋并在车上静静地呆上3个小时，来放纵我的思维。那个特殊的晚上我正在想着我计划中的DNA测序实验。车行至Cloverdale附近，这里从美国101国道西北方向分支出加利福尼亚州128支路，公路沿海岸线蜿蜒而曲折，我断定如果用两条寡核苷酸而不是一条时，结果将更可靠。由一条寡核苷酸引导靶DNA一条链的合成，我可以获得关于两条链的互补序列的信息。Mullis教授回忆的故事因此，这个实验在没有过多不便的条件下包含了一个内在的控制手段。虽然我当时没有认识到这一点，即用我大脑构想出来的两条寡核苷酸链。它们的3’引物末端在靶基因互补链上指向对方，我处于发现聚合酶链式反应的边缘。然而，我感受最深的是山路的边缘。Mullis教授回忆的故事那天晚上，空气中弥漫了潮湿气味和七叶树花瓣的香味。对路边白色树干不经意的一瞥使我脑海中闪现了火花……太高兴了，在脑海中我开始了对2的乘幂：2，4，8，16,32……。我隐约记起2的10次幂是大约1000，并且2的20次幂大约为一百万。我停下我的汽车在公路旁侧，俯瞰安德森山谷。从手套兜里拿出铅笔和纸——我需要验算我的计算。我的熟睡着的乘客Jennifer晕头晕脑地抗议我停下车来及它的灯光，但我大叫说：我有了一个奇妙的发现。她不知所以然的又睡去了。我确证2的20次幂确实超过了一百万以上，并且可依此类推。沿这条路又走了大约一英里，我发现了反应产物中的其他方面。用引物进行几轮延伸后，延伸产物解链，再与新的引物杂交并延伸，呈指数增长的DNA链的长度是固定的。因为它们的末端被寡核苷酸引物的5’引物末端严格限制。我可以通过设计与序列两端杂交的引物来获得起始DNA样品的较大片段。这个片段是一个特定长度的分离的单元。Mullis教授回忆的故事Mullis教授回忆的故事我再次停下车来,并开始画与DNA线性分子杂交和延伸的流程，一个循环的产物成为下一个链式反应的模板……。Jennifer晕晕糊糊地再次抗议。“你不会相信，”我大叫，“简直不可思议!”她拒绝起床。我继续向小木屋前进再没有停下来。安德森山谷的终点是红树县（Redwoodcountry）的起点，并且是游手好闲者居住的地方。我的发现使我仿佛感觉我已打破了这个古老山谷的寂静，那天晚上在我脑海中爆发的脱氧核糖核苷酸使我彻夜未眠。PCR的发明是DNA操作技术的革命

复习

五要素及其特点反应过程产物类型

产物累积特点

聚合酶链反应(2)

（Polymerasechainreaction,PCR)

检验医学院

周兰分子诊断学五大要素？本讲内容1PCR概述2PCR原理3PCR产物检测与分析方法4PCR特点及应用5PCR技术发展简史6PCR衍生技术7荧光定量PCR8其它基因扩增检验技术9PCR相关检验的质量管理

6PCR衍生技术逆转录PCR单细胞PCR巢式PCR原位PCR多重PCR不对称PCR等温扩增……

即让扩增产物的5’-末端带上一段特殊的、满足需要的DNA顺序的PCR方法：在设计其引物时，除与模板配对的那一部分外，再加上若干碱基，这样使扩增产物的末端加上额外的一段DNA目的：使PCR产物带上特定功能或用途的DNA片段，如：特殊酶切位点、启动子、点突变等末端可加碱基的数量：约为十几～几十bp6-1加端PCR（add-PCR）：DNA重组：合成RNA探针蛋白质结合序列：

产物纯化、检测核糖体结合序列：

高效表达

在组织细胞内进行PCR扩增，*通过标记引物以直接显色（原位PCR)*或采用原位杂交进行检测即原位杂交PCR，可揭示该特异序列在细胞中存在的量和部位

可用标本：

新鲜组织、石蜡包埋组织脱落细胞、血细胞等6-2原位PCR（InSituPCR）①固定组织或细胞：多聚甲醛②蛋白酶K消化处理，以便PCR试剂进入细胞③PCR扩增：加PCR反应液在组织细胞片上覆盖液体石蜡后，进行PCR④显微镜观察结果**直接显色：显色扩增产物情况**原位杂交：PCR后行原位杂交检测扩增的靶序列情况基本步骤

原位PCR的优点

具有定位能力的原位杂交

+

高度特异和敏感的PCR（1）既能鉴定带有靶序列的细胞(定性、定量），

又能标出靶序列在细胞内的位置（细胞内定位）

是细胞和分子水平研究以及临床细胞学诊断领域里的一项有较大潜力的新技术，尤适用于检测病理切片中含量较少的靶序列（2）其特异性和敏感性：高于一般的PCR*勿需分离提取待测靶序列（无损失）

*杂交的放大作用等Haase等1990年首创：不破坏细胞、并利用完整的细胞作为一个微小的反应体系实现扩增比较：

**原位杂交：可鉴定细胞内特异序列的量及存在部位；但如其拷贝数<10,该方法的敏感度就明显下降

**标准PCR：可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却不能显示其存在部位可检测*外源性基因--胞内病毒感染（HIV-1与AIDS病；HPV与尖锐湿疣、宫颈癌及阴茎癌；EBV与鼻咽癌；HBV和HCV与肝炎及肝细胞癌）

导入基因的检测（转基因动物植物、基因治疗等）*内源性基因--胞内基因重排、细胞内RNA表达水平

肺腺癌:部分癌细胞及间质细胞p16阳性（原位PCR)“原位PCR使光学显微镜超过电子显微镜，

向生物化学及遗传学领域延伸”

原理：*在逆转录酶的作用下，以合成的多聚T为引物（与PolyA尾互补)、以mRNA为模板合成互补的cDNA*再以cDNA为模板，进行PCR反应*如此，低丰度的mRNA得以扩增放大(pg到ng、μg），显著提高mRNA检测的灵敏度

常用的两种逆转录酶AMV（avianmyeloblastosisvirus，鸟类成髓细胞白血病病毒

），酶最适温度42℃MMLV（Moloneymurineleukemiavirus，Moloney小鼠白血病病毒），酶最适温度37℃

6-3逆转录PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）

RT-PCR原理示意图*氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA链，解离的第一链cDNA的3’-末端就会形成一个发夹环（是第一链cDNA合成时的特性，原因至今未知）*发夹环引导DNA聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的*再利用S1核酸酶将连接处单链切断形成平端*最后用特异引物（针对该基因的）行PCR

Oligo-T

RT-PCR用途*分析基因的转录水平（半定量）

&用于基础研究

&临床常用于基因表达、RNA病毒的检测

*获得目的基因，用于重组DNA技术*制备cDNA探针，用于杂交和芯片技术

##RT-PCR具有半定量的功能

选用管家基因mRNA作为内参

管家基因mRNA和目的mRNA混合物共同进行逆转录再在各自的特异引物引导下,以cDNA为模板扩增计算出扩增后目的cDNA/管家基因cDNA的比值，从而达到半定量的目的如：比较12号样品中，BMP2和4的表达量高低比较各样品间BMP2或4的相对表达量高低

在许多研究过程中，只需评估样品之间某种基因表达水平的相对差异,半定量RT－PCR技术完全可以满足上述目的的要求与基因表达研究的经典方法NorthernBLOT相比,半定量RT－PCR法以其灵敏度高(1千～1万倍)、专一性好、快速简便和不需已知浓度的标准品等优点而得到广泛的应用

半定量RT-PCR的不足●由于管家基因的mRNA与靶基因使用不同的引物，两种mRNA在序列、大小及二级结构上可能亦存在较大的差异，使两者的扩增效率存在差异，从而影响定量的准确性●不同来源的组织或细胞的mRNA可能有着不同的逆转录效率，这种逆转录效率的差异在随后进行的PCR中被百万倍地放大（当比较不同细胞中某基因的表达时）

6-4不对称PCR（asymmetricPCR）目的：获得大量单链的靶DNA片段

用途：制备DNA测序的模板制备核酸杂交的探针方法：采用不同浓度的一对引物（分别称为限制性引物和非限制性引物）其最佳比例一般是0.01：0.5μM

（1:50～100，关键是限制性引物的绝对量）

原理

最初的10-15个循环中的主要产物是双链DNA；但是，当低浓度的引物（限制性引物）被耗尽后，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果便产生大量单链DNA（ssDNA）

另一方法:先用等浓度的引物进行PCR扩增，制备双链DNA(dsDNA)；再以此dsDNA为模板、其中一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA

高浓度引物低浓度引物

6-5多重PCR（multiplePCR）

目的：检测一组特定基因序列的存在或缺失

原理和方法：在同一反应体系中加入多对引物，

以扩增同一模板的多个区域

（同一基因内或不同基因中的多个部位）

结果：如果其中某一区段缺失，则电泳图谱上该条带就会消失

多重PCR1）同时检测多种病原体或鉴定是哪型病原体感染。可组合系统的有:①肝炎病毒的感染：在同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，如甲乙丙型肝炎病毒重叠，或甲乙型肝炎病毒重叠，或乙丙型肝炎病毒重叠②肠道致病性细菌的检测：如伤寒，痢疾和霍乱，它们可表现出相同的肠道症状，并且有时痢疾、霍乱可同存一病人，并同时发病

多重PCR的意义和应用③性病的检测：如梅毒、淋病及艾滋病④战伤细菌及生物战剂细菌的检测：

如破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌等2）用于检测疾病相关基因十分庞大的疾病

如视网膜母细胞瘤、进行性肌营养不良症等。这些疾病的相关基因上常有多处缺失或突变，且彼此相隔数十或数百kb

常规PCR技术难以同时扩增它们设计其多对引物时应该注意哪些方面？？？

多重PCR的意义和应用Tm值相似：Tm很大程度上决定着退火温度

如其悬殊，则很难选择一个合适的退火温度，易致其中有的引物的扩增效率差，甚至产生假阴性跨度相近：

跨度小的引物的扩增效率明显优于跨度大者

*还要注意各引物对的用量

设计多重PCR的多对引物时必须注意①高效性：在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体

②系统性：多重PCR很适宜于成组的病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时检测③经济简便性：多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间、试剂

多重PCR的特点6-6巢式PCR（nestedPCR）

1）定义及原理

用两对PCR引物扩增一完整DNA片段，以提高检测的灵敏度和特异性第一对引物（外引物，outerprimer）

其对应序列在模板外侧；其扩增片段与普通PCR相似第二对引物即巢式引物（内引物，innerprimer）

它结合在第一次PCR产物内部，其扩增片段短于第一次扩增产物

第一轮：外引物，原始模板，15-20循环的标准扩增第二轮：*巢式引物（内引物），将一小部分上轮扩增产物稀释100-1000倍作为第二轮的模板*或通过凝胶纯化，再选择所需大小的扩增产物作为新的模板，15-25个循环第二对引物的功能：特异性扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段，即真正的目的序列

2）过程6-6巢式PCR（nestedPCR）-特异，敏感6-6巢式PCR（nestedPCR）-特异，敏感经过这样两次PCR放大，便可将单拷贝的目的DNA片段特异、敏感地检出

（1）两对引物、两轮扩增：尽管总循环数依然有30-40，但是却几乎不受平台效应的影响，扩增效率高，提高检测的灵敏度（2）更高的特异性：

能够同时与两套引物都互补的靶序列应该很少很少（3）也可采用同一反应管的巢式PCR

主要利用内、外引物的Tm值不同。

外引物的退火温度高于内引物退火温度，即一次操作，两次PCR扩增，可减少交叉污染机会

特点

用荧光素等标记PCR引物，以便直观地检测目的基因*用不同颜色的荧光染料分别标记不同引物，同时扩增这几个DNA区段，电泳后各扩增产物呈不同颜色荧光，也称彩色PCR；如果某一区带缺失，则会缺失相应的颜色此法只是定性检测PCR产物，用于检测基因突变、染色体重排或转位、基因缺失及微生物分型等*特适合临床标本的基因诊断（可同时检测多种基因）

6-7标记引物的PCR（LabelledprimersPCR）

&不必提取基因组DNA，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，通常利用此方法进行重组体的筛选，省时省力

&建议使用载体上的通用引物

&PCR产物大小是该通用引物之间的插入片段大小

6-8菌落

PCR

（

Colony

PCR

）6-9单细胞PCR组织或体液中，绝非单一细胞种类常规的PCR的模板都来自多细胞如何能够对单一的细胞中的模板进行研究？*首先需要分离单个细胞流式细胞技术膜片钳技术激光捕获显微切割技术等例如：激光捕获显微切割技术即Lasercapturemicrodissection（LCM）technology在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞成功地解决了组织中的细胞异质性问题，从而可以进行单个细胞或单一细胞群的各种研究（蛋白质组、核酸等）LCM程序先将含所需细胞的组织切成片（石蜡包埋的、冰冻的等）倒置显微镜下选中要获取的细胞系统接到指令后切片的下方发出激光，激光束将选中的细胞切割并弹出收集在管中：数秒钟裂解细胞后

RT-PCR或PCR或先预扩增—普遍扩增基因组DNA，再特异扩增靶基因

如何扩增全部基因组DNA引物延伸预扩增技术（primer-extensionpre-amplification,PEP）

随机引物：人工合成的、含有各种可能排列顺序的多核苷酸片段的混合物（如随机引物标记法中的46）；可以与任何核酸片段杂交，作为聚合酶的引物

PEP中是由15nt组成的随机引物（415种引物），与染色体上核苷酸序列随机互补多个循环后，基因组DNA的拷贝数就足够后面扩增用6-10等温扩增（P72）自学7荧光定量PCR7-1为什么要做定量测定？基因诊断的需要

1997年卫生部下文禁止将普通PCR用于临床诊断药物对基因表达水平的影响动态监测治疗的效果用于基因表达方面的研究如特定时间或特定条件下特定mRNA的定量测定7-2常规PCR是否可以准确定量？常规PCR是PCR结束后，才检测其对象是PCR扩增反应的终产物

试验：*相同模板*同一PCR仪*96次扩增*扩增曲线如右图

可见终产物水平（最后获得的DNA拷贝数）波动大WHY?各种因素的复杂的相互作用，导致不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台水平存在明显差异SO,如用于定量，极不可靠。又该如何定量???(fluorescentquantitativePCR,FQ-PCR)

（realtime

fluorescentPCR,实时荧光PCR)

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号监测整个PCR过程，获得在线描述PCR过程的动力学曲线，最后通过标准曲线对起始核酸模板进行定量分析

即对PCR扩增反应中每一次循环的产物进行实时检测、定量7-3荧光定量PCR定义7-4FQ-PCR定量的理论基础

循环阈值（Ct）虽然终点处产物量不恒定但是，它们的拐点则极具重现性拐点：荧光信号从本底进入指数期的最初阶段

循环阈值（cyclethreshold,Ct）

在PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，即Ct

是FQ-PCR定量的理论基础

荧光信号阈值（threshold）：一般将前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值真正的信号：超过域值的荧光信号Ct的实际定义：基线上方可检测到的、统计学上有显著荧光信号时所对应的循环次数或者，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数7-5FQ-PCR定量的方法绝对定量（测定X的分子数量）即用已知的标准曲线来精确推算待测的起始模板拷贝数，又称外标法相对定量（即测定不同样本中X的比率）在一定样本中，靶分子相对于参照样本中该分子的量的变化程度，又称内标法1)外标法-绝对定量用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线

横坐标：起始拷贝数的对数纵坐标：Ct值因此，只要获得待测样品的Ct值即可从标准曲线上计算出其起始拷贝数

“外”—指标准品与待测品虽然在相同反应条件下进行，但它们不在同一反应管！

荧光强度与循环数的曲线初始模板浓度的对数与Ct值的标准曲线10410310610510210

荧光定量标准曲线Ct与模板DNA浓度的关系：Ct=-klogX0+b起始模板DNA量越多，荧光达到域值所需的循环数（Ct）越少通过系列已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线再根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量Log浓度与Ct值呈线性关系，即Ct与模板起始拷贝数的对数成反比

Ct与模板DNA浓度的关系：Ct=

-

klogX0+b

外标法注意事项*标准品是已知拷贝数的质粒DNA

可自制，也有商品化供应*要系列稀释，5个点以上*要设立阳性和阴性对照*每个样品重复实验3次以上*Ct值应在18-30之间（指数期），过大或过小都将影响实验数据的精度临床实验室应用最多2)内标法-相对定量

“内”指标准品与待测分子在同一管内，通过内标的量来计算待测模板的量，从而可排除管间扩增效率的不同所致的误差据其所用的标准品又分为非竞争性内标准品：内源或外源的、与靶基因无关、在整个细胞周期中均匀表达的基因。通常是管家基因，如丙酮酸脱氢酶、rRNA或β-肌动蛋白的基因竞争性内标准品：人为构建的、可与原始靶核酸竞争酶、核苷酸和引物分子的核酸标准品。应尽可能近似原始待测基因

从理论上说，竞争性内标法是最理想的定量方法，但是，还存在较多问题需要解决内标法