枸杞RAPD反应体系的建立与优化

枸杞RAPD反应体系的建立与优化【摘要】目的探索枸杞RAPD反应体系并对其进行优化。方法在本实验室常用的RAPD反应体系的基础上，根据RAPD扩增效果确定枸杞基因组DNA的最佳RAPD反应体系。结果建立了适合枸杞的RAPD反应体系：20μl体系中含1×PCRbuffer，50ng模板，μM10碱基随机引物、1UTaqDNA聚合酶、2mMMg2+，125μMdNTPs。结论枸杞的RAPD反应体系能够用于枸杞的RAPD分析。

【关键词】枸杞；RAPD；反应体系

EstablishmentandOptimizationofRAPDReactionSysteminLyciumbarbarum

Abstract：ObjectiveTostudytheRAPDreactionsysteminLyciumbarbarumL.andoptimizationofit.MethodsBasedontheRAPDreactionsystemwasoftenusedinourlab,RAPDreactionsystemwastestedbytheresultofRAPD.ResultsAnRAPDreactionsystemsuitableforLyciumbarbarumL.wasestablished,thatwas,20μlamplificationcontaining1×PCRbuffer,50ngtemplateDNA,μmprimer,1UTaqDNApolymerase,2mmol/LMg2+,125μmol/LdNTPs.ConclusionTheRAPDreactionsystemcanbeusedtoRAPDanalysisinLyciumbarbarum.

Keywords：Lyciumbarbarum；RAPD；Reactionsystem

RAPD由Williams和Welsh两个研究小组几乎同时于1990年建立起来的一项分子标记技术［1，2］，是目前中药研究者最常使用的DNA标记技术，但RAPD易受各种因素的干扰，其最佳扩增条件在不同物种各有不同，因此在对枸杞进行RAPD分析时，完全有必要对各因子的反应条件进行优化，建立稳定的、最佳的反应体系。本研究力图通过实验建立一种适合枸杞的RAPD反应体系。

1材料与方法

材料实验所用的材料为枸杞道地品种宁夏枸杞的主栽品种宁杞1号，采自宁夏农业生物技术重点实验室试验地。

仪器与试剂PCR仪；电泳仪；电泳槽；SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪；Eppendorf5415D离心机；UVPGDS-8000凝胶成像系统。

Buffer、TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、300bpDNAladder购自北京天为时代公司，10碱基随机引物购自上海生工生物工程有限公司，Agarose，EB。

方法

枸杞基因组DNA提取枸杞基因组DNA提取根据严奉坤等［3］的提取法进行。

PCR扩增及电泳检测反应在PTC-200型PCR仪上进行。初始扩增条件采用本实验室长期使用的20μl反应体系，其成分为：10×Buffer加μl25mmol/LMg2+，1μlmmol/LdNTPs，1UTaqDNA聚合酶，1μlμmol/L10碱基随机引物，50ng模板。反应程序：预变性94℃2min；预扩增程序：94℃20s，36℃30s，72℃1min，5个循环；扩增程序：94℃20s，40℃30s，72℃1min，40个循环；然后72℃延伸10min，最后4℃保存。扩增产物经含有μg/mlEB的%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结束后在UVPGDS-8000凝胶成像系统上观察照相。

2结果

RAPD标记对PCR反应条件有较高的要求，因此在实验前需要建立严格稳定的反应体系，以确保准确、稳定地扩增。将模板DNA浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、Mg2＋浓度、dNTPs浓度、退火温度和循环次数按单因素试验方案进行扩增实验，得到优化体系的结果。

DNA浓度在PCR反应体系体积为20μl，引物浓度μmol/L、TaqDNA聚合酶1U、Mg2＋浓度mmol/L、dNTPs浓度125μmol/L条件下，设定模板梯度，1，2，20，200，500，1000和2000ng/20μl，以确定适宜的模板浓度。结果见图1所示。从图1看出：每反应中模板的终浓度小于1ng/μl时无扩增；在模板终浓度为1～10ng/μl的范围内有最佳的扩增,RAPD带的式样完全重复；而超出此浓度范围如在25ng/μl时扩增式样改变并丢失大部分带，在50ng/μl和100ng/μl时扩增产物一片弥散。

引物浓度在PCR反应体系体积为20μl，模板浓度50ng/20μl、TaqDNA聚合酶1U、Mg2＋浓度mmol/L、dNTPs浓度125μmol/L条件下，设定随机引物浓度，，和μmol/L，以确定适宜的引物浓度。结果见图2所示。从图2看出：引物浓度μmol/L时，扩增出的带型清晰、完整且背景较浅。相比之下，过高和过低都不能真实地反映扩增结果，引物浓度过高使得扩增的条带数减少，亮度下降，引物浓度过稀会使亮度下降。

TaqDNA聚合酶用量在PCR反应体系体积为20μl、模板浓度50ng/20μl、引物浓度μmol/L、Mg2＋浓度mmol/L、dNTPs浓度125μmol/L条件下，设定TaqDNA聚合酶0.5，1，1.5和2U，以确定适宜的TaqDNA聚合酶用量，其结果图3所示。从图3看出，酶用量过低不能得到扩增产物，1～2U的酶用量不会明显地影响扩增结果。

Mg2＋浓度在PCR反应体系体积为20μl、模板浓度50ng/20μl、引物浓度μmol/L、TaqDNA聚合酶1U、dNTPs浓度125μmol/L条件下，设定Mg2＋浓度1，，和mmol/L，以确定适宜的Mg2＋浓度，其结果图4所示。从图4看出，随着Mg2＋浓度的提高主带亮度逐渐增强，扩增带条数减少，弱带消失,在2mmol/L时带型稳定且亮度适宜。

图1模板DNA浓度对枸杞RAPD扩增的影响(ng/20μl)

图2引物浓度梯度实验

图3TaqDNA聚合酶用量梯度实验

图4Mg2＋浓度梯度实验

图5dNTPs浓度梯度实验

图6退火温度梯度实验(℃)

图7循环次数梯度实验

dNTPs浓度在PCR反应体系体积为20μl、模板浓度50ng/20μl、引物浓度μmol/L、TaqDNA聚合酶1U，Mg2＋浓度mmol/L条件下，设定dNTPs浓度50，100，150和200μmol/L，以确定适宜的dNTPs浓度。结果见图5所示。从图5看出，随着dNTPs浓度的提高主带亮度逐渐增强，在150μmol/L时带型稳定且亮度适宜。

退火温度在PCR反应体系体积为20μl、模板浓度50ng/20μl、引物浓度μmol/L，TaqDNA聚合酶1U，Mg2＋浓度2mmol/L、dNTPs浓度150μmol/L条件下，设定退火温度梯度34，36，38和40℃，以确定适宜的退火温度。结果见图6所示。从图6看出：退火温度过低会有非特异性扩增条带出现，36～40℃能得到稳定的结果。

循环次数在PCR反应体系体积为20μl，模板浓度50ng/20μl，引物浓度μmol/L，TaqDNA聚合酶1U，Mg2＋浓度2mmol/L，dNTPs浓度150μmol/L条件下，设定循环次数梯度35，40，43和46，以确定适宜的循环次数。结果见图7所示。从图7看出，随着循环次数的增加扩增量显着提高，循环40次带型稳定且亮度适宜。

综上，最终确定整个反应体系各种试剂的浓度：模板20～200ng、随机引物浓度～μmol/L，TaqDNA聚合酶1～2U，Mg2＋浓度～mmol/L，dNTPs浓度100～200μmol/L。根据实验结果，整个反应体系各试剂的用量如表1所示。

表1PCR反应体系各试剂用量

反应程序为：预变性94℃2min；预扩增程序：94℃20s，36℃30s，72℃1min，5个循环；扩增程序：94℃20s，40℃30s，72℃1min，40个循环；然后72℃延伸10min，最后4℃保存。

优化的PCR反应体系扩增结果的稳定性为了验证优化的PCR反应体系扩增结果的稳定性，随机挑选了筛选出的15条随机引物运用表1所示的反应体系进行了扩增，其结果如图8所示：所有引物都能得到好的扩增结果,说明优化的反应体系的扩增是稳定的，只要反应条件一致，RAPD标记方法是完全能够经得起重复的。

表2随机引物序列及编号

图815条引物扩增宁杞1号的RAPD图谱

3讨论

PCR反应体系的各种成分是一个有机的整体，对于RAPD而言，在进行一个新类群的RAPD-PCR时应事先确定该类群的最适DNA模板浓度范围；由于RAPD-PCR中模板与引物浓度的比例影响扩增产物的质与量，直接关系到可重复性，这种情况与常规PCR不一样，在特异性扩增中，增加模板或引物浓度时，可期望得到

［1］WilliamsJG,KubelikAR,LivakKJ,etal.DNApolymorphismsamplifiedbyarbitraryprimersareusefulasgeneticmakers［J］.NucleicAcidsRes,1990,25(18):6531.

［2］WelshJ,McclellandM.Fingerprint