土壤绿僵菌分离方法的比较研究

土壤绿僵菌分离方法的比较研究

绿僵硬菌（粉末状昆虫）是优良的寄生虫，在预防和控制农业害虫方面得到了广泛应用。土壤是绿僵菌宿存的重要场所,是绿僵菌资源的主要来源渠道,但因土壤中的大量非目标真菌,如黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(A.niger)、毛霉(Mucorracemosus)等与绿僵菌的生长条件相近,而且生长速度比绿僵菌快,常导致绿僵菌分离过程中大面积污染,影响分离效率。绿僵菌在土壤中的宿存和持续控制害虫能力等研究中均涉及到从土壤中分离绿僵菌的过程,统计施放绿僵菌后的种群时空动态,需能有效分离但不抑制绿僵菌生长的分离培养基,并能保证分离过程中绿僵菌的生长不受非目标菌的影响。因为生长条件和营养条件相似,真菌污染在绿僵菌分离过程中较易发生,在分离培养基中添加抗生素是控制绿僵菌污染的有效方式。目前市场上真菌抗生素主要有氨基糖苷类抗生素,如井冈霉素和春雷霉素;核苷类抗生素,如武夷菌素、多抗霉素、宁南霉素等;四环素类抗生素,如金霉素和土霉素;多烯类抗生素,如近年来应用较多的放线菌酮和两性霉素B类;大环内酯类抗生素,如梧宁霉素;多醚类抗生素,如莫能菌素。本研究以土壤中6种非目标优势真菌和2种绿僵菌为供试菌,评价了3种真菌抗生素对目标菌和非目标菌的抑制作用,旨在筛选出对土壤中的优势真菌有较好抑制效果但不影响绿僵菌生长的抗生素种类和浓度,用于绿僵菌的分离。1材料和方法1.1各类菌株siga供试药剂有伊曲康唑(西安杨森制药有限公司生产)、两性霉素(Amresco公司生产)、放线菌酮(Sigma公司生产)。供试菌株有金龟子绿僵菌(M.anisopliae)Ma09和黄绿绿僵菌(M.flavoviride)FI985,均由广东省林业科学研究院提供。1.2小鼠sda平板的制备土壤采集于广东省内的苗圃地、桉树林地和松树林地,独立保存带回实验室进行分离。在无菌条件下,取5g土样置于容量为100mL三角瓶内,加入0.3%吐温-80无菌溶液50mL,200rpm下振荡20min,静置3min后,再取上层溶液,用无菌水进行连续4次10倍梯度稀释,获得5个浓度的菌悬液。取不同浓度的菌悬液100μL均匀涂于萨氏培养基(SDAY)平板(直径为9cm),在(26±1)℃下暗培养3~4d,挑取单菌落点接于无菌的SDAY平板进行纯化、鉴定。鉴定后转接于SDAY斜面培养基,保存于广东省林业科学研究院。1.33真菌抗生素的筛选毛霉、黄曲霉、黑曲霉、青霉(Penicilliumcommune)、拟青霉(Paecilomycesfumosa-roseus)、灰霉(Botrytisci-nerea)在土壤内含菌量高、生长速度快,易造成绿僵菌分离时大面积污染,故选为真菌抗生素抑菌效果的测试对象。在SDAY培养基添加不同浓度伊曲康唑(5,10,25,50,100,200μg/mL)、两性霉素(1,5,10,50,100,200μg/mL)和放线菌酮(1,5,10,20,50,100μg/mL),制成抑菌培养基平板(直径为9cm)。用接种针挑取供试的6种真菌孢子(菌丝)点接于抑菌培养基平板中央,每处理5重复,(26±1)℃暗培养。以不加真菌抗生素的SDAY平板作对照(CK),接种后第3天起,每24h用十字交叉法测量各菌落直径,至菌落长满培养皿。计算3种真菌抗生素对各真菌的相对抑制率,将相对抑制率转换成几率值(Y)、药剂浓度转换成以10为底的对数值(lgx),做线性回归,得毒力回归方程(Y=algx+b)和相关系数(R),计算3种真菌抗生素对供试6种土壤非目标真菌生长的有效抑制浓度(EC50和EC90),结合相对抑制率评价真菌抗生素对6种非目标真菌抑制作用的强弱。相对抑制率A=(B-C)/B×100%式中,B为对照组菌落平均直径(mm),C为处理组菌落平均直径(mm)。1.43菌株对绿匹菌生长的影响在添加终浓度为200μg/mL的伊曲康唑、100μg/mL的两性霉素和100μg/mL放线菌酮的SDAY培养基平板中央,分别点接金龟子绿僵菌Ma09和黄绿绿僵菌FI985孢子,每处理5个重复,(26±1)℃暗培养,以不加真菌抗生素的SDAY培养基作对照,接种后采用十字交叉法每天测量绿僵菌菌落直径,按1.3的方法计算相对抑制率,评价3种真菌抗生素对绿僵菌生长的影响。1.5处理数据应用DPS和Excel软件进行方差分析、Duncan新复极差分析和毒力回归分析。2结果与分析2.1种真菌的抑制率及毒力回归分析2.1.1菌落生长趋势不同浓度的伊曲康唑、两性霉素和放线菌酮对供试的6种非目标真菌均有抑制作用,且真菌抗生素浓度越大菌落生长越慢。图1~2是以黄曲霉、青霉和黑曲霉为例,在不同浓度的伊曲康唑、两性霉素和放线菌酮作用下的生长变化趋势。图3~4表明,接种后第4天,3种真菌抗生素对6种非目标真菌均有抑制作用,同种抗生素对真菌的相对抑制率随药剂浓度的增加而提高。不同真菌抗生素对供试菌的抑菌效果差异明显,伊曲康唑对黑曲霉和毛霉的抑制效果较差,在浓度为100μg/mL时对其它4种真菌均有较好的抑制效果;两性霉素对6种真菌的抑制效果较一致,对黄曲霉最佳,在浓度为100μg/mL时即可完全抑制其生长;放线菌酮对灰霉和拟青霉有较好抑制效果,在浓度为50μg/mL时即可完全抑制灰霉的生长。2.1.2相对抑制率分析伊曲康唑在测试浓度范围内均不能完全抑制供试菌的生长,对黄曲霉和青霉的抑制率要高于其他几种供试菌,对青霉的抑制率平均超过70%;对黄曲霉的抑制率,除了5μg/mL浓度外,其他浓度达到70%以上(表1)。对毛霉和黑曲霉的抑制效果最差,对毛霉最高抑制率为54.84%。两性霉素浓度为100μg/mL及以上可完全抑制黄曲霉的生长;浓度为25μg/mL时,对黑曲霉和灰霉抑制率分别为70.09%和73.73%。两性霉素对毛霉的抑菌效果比伊曲康唑好,当浓度为100μg/mL时,抑制率为74.77%;当浓度为200μg/mL时对6种供试真菌的相对抑制率达到76%以上。放线菌酮对灰霉抑菌效果较好,浓度为50μg/mL时即可完全抑制灰霉的生长,1μg/mL也可达到61.9%的抑制率。当浓度达到50μg/mL时对黄曲霉和毛霉的抑制率达到90%以上,对于拟青霉和青霉也达70%以上。当浓度为100μg/mL时,对于6种供试菌抑菌率均达到75%以上,其中毛霉、拟青霉和灰霉均为100%。2.1.3毒力回归分析3种抑菌剂对6种真菌的毒力回归分析表明,各回归方程均能较好的拟合(R>0.84)(表2)。抑制浓度(EC50,EC90)分析表明,3种真菌抗生素对供试6种真菌的抑制效果差异明显。伊曲康唑对青霉、拟青霉、灰霉、黑曲霉和黄曲霉有较好的抑制效果,EC50分别为0.54,3.33,3.96,3.97,6.93μg/mL;对毛霉的抑制效果较差,EC50达90.57μg/mL。两性霉素对毛霉的抑制效果比较差,对灰霉抑制效果最好,EC50仅为3.23μg/mL,对另外4种真菌的EC50为9.48~16.59μg/mL。放线菌酮对灰霉抑制效果最好,EC50为6.87μg/mL,而对于其他5种真菌抑制效果相当,EC50为13.82~27.43μg/mL。两性霉素和放线菌酮浓度分别为35.28,27.43μg/mL时即对6种真菌可达到50%的相对抑制率。伊曲康唑作用于毛霉和两性霉素作用于黑曲霉的EC90都极大,表明2种真菌抗生素无论浓度多大,对供试菌都不能百分百抑制。2.23两性霉素作用下的菌落直径接种后第3,4,5天,3种真菌抗生素作用下2株绿僵菌菌落直径间均差异极显著(P<0.01)(表3)。其中放线菌酮作用下的菌落直径与对照差异不显著;两性霉素作用下除了第4天FI985菌株的菌落直径与对照差异不显著,其他处理均显著小于对照;伊曲康唑作用下2株绿僵菌接种第3,4,5天的菌落直径均显著小于对照,结果表明伊曲康唑和两性霉素对绿僵菌具有一定的抑制作用,且伊曲康唑大于两性霉素,放线菌酮对绿僵菌的抑制作用不明显。3不同微生物素对绿匹菌菌落生长的影响综合伊曲康唑、两性霉素和放线菌酮对灰霉、拟青霉、黄曲霉、黑曲霉、毛霉、青霉的生长抑制效果分析,两性霉素和放线菌酮均能有效控制6种非目标真菌的污染,抑制效果比伊曲康唑好,且以放线菌酮为最优。伊曲康唑对绿僵菌菌落生长的影响显著大于两性霉素和放线菌酮;放线菌酮作用下的绿僵菌菌落直径与对照间差异不显著,当浓度为27.43μg/mL时对6种供试非目标真菌的抑制率即达50%,浓度为50μg/mL时