季铵盐型双子表面活性剂对缓冲溶液中白蛋白的相互作用

季铵盐型双子表面活性剂对缓冲溶液中白蛋白的相互作用

表面活性剂与双亲性小分子物质之间的相互作用在食品、药物和护理等领域具有重要意义。在生物化学研究中，十二烷基磺酸钠-聚吡咯烷基胶体的电泳法确定了蛋白质的含量，这是两者相互作用的成功应用。从模仿的角度来看，对蛋白质和表面活性剂之间的相互作用的研究提供了了解蛋白质和类脂化合物或构合物的结合的有价值模型。血清白蛋白是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质,它能够储存和转运众多的内源性和外源性物质.由于血清白蛋白在生理上的重要性和易于分离、提纯而常被用作模型球蛋白[3~6]来研究其与表面活性剂、金属离子或药物分子之间的相互作用,以期在分子水平上揭示相关生命过程的奥秘.近年来有不少血清白蛋白-表面活性剂相互作用的研究报道,主要用差示扫描量热、荧光光谱、等温滴定量热、圆二色法、光散射、核磁共振等方法研究了传统型表面活性剂与血清白蛋白的相互作用[7~12].双子表面活性剂(Gemini)分子中含有两个亲水基(离子或极性基团)和两条疏水链,在其亲水基或靠近亲水基处,由联接基团通过化学键联接在一起.联接基团的介入及其化学结构、联接位置、刚性程度及链长等因素的变化,使Gemini的结构具备多样化的特点,进而对其溶液和界面等性质产生影响,使之具备更加优良的物理化学特性.因此,研究血清白蛋白与Gemini的结合规律可帮助人们更深入地了解亲水-憎水等弱相互作用在生物大分子溶液中的重要性.等温滴定量热法(ITC)是近年来发展起来的一种在线和无损伤地研究生化热力学和生化动力学的重要方法,特别适应于研究与蛋白质等生化大分子相关的各种热力学过程[13~15].但迄今为止,应用该法研究表面活性剂与蛋白质的相互作用的报道不多[16~21].本工作用等温滴定量热法结合圆二色法技术研究人血清白蛋白与季铵盐双子表面活性剂的相互作用,测定其结合常数、结合位点数以及热力学函数变化,并从微观结构出发加以讨论.重点考察了双子表面活性剂疏水链长短对热力学性质变化的影响.1实验部分1.1n4-甲基-3-甲基苯磺酸酯h3的合成人血清白蛋白(HSA)购自Sigma公司,其溶液浓度用称重法测定,所用分子量为66.5kDa.季铵盐双子表面活性剂[CnH2n+1(CH3)2NCH2CHOHCH2N(CH3)2CnH2n+1]Cl2(n=12,14),简记为(CnN)2Cl2,参照文献合成,在丙酮(AR)中重结晶提纯至符合纯度标准即水溶液的表面张力对表面活性剂的浓度曲线上不出现极小点.实验用水为碱性高锰酸钾存在下制备的二次蒸馏水.配制缓冲溶液(0.01mol·L-1,pH7.0)所用三羟甲基氨基甲烷和盐酸均为分析纯.1.2实验方法和过程:关于蔗糖的标定和标定,hsa量热实验由纳瓦级滴定式微量热计(ThermalActivityMonitorTAM2277,瑞典ThermometricAB公司)完成,用随机所带Digitam4.1软件控制实验过程并进行数据采集和处理.通过测定蔗糖稀释焓验证,该量热计的电标定精密度好于±1%.将表面活性剂(CnN)2Cl2溶液装入250µLHamilton注射器,用612LundSyringePump注射泵,每次滴8.00µL于0.50mLHSA溶液中.滴定时间间隔足够长(45min),以使信号返回基线.安瓿中搅拌器转速固定在30r·min-1,待基线在搅拌下稳定后启动实验,以使因搅拌而产生的热量被自动扣除.实验温度为(298.15±0.01)K.为扣除(CnN)2Cl2和HSA的稀释热,分别进行(CnN)2Cl2溶液向缓冲溶液中滴定和缓冲溶液向HSA溶液中滴定的实验.1.3级结构相对含量的测定HSA是光学活性物质,因此可测定它的圆二色(CD)谱,从而了解其构象.实验所用仪器为JascoJ-810圆二色谱仪(Japan),光源系统用氮气保护(流量为5L·min-1),样品池的光径为0.1cm.测量参数:扫描速率100nm·min-1,分辨率0.1nm,响应时间1s,累积次数3次.扫描波段为190~250nm.HSA浓度为2µmol·L-1.实验时向HSA中分别加入不同量的(C12N)2Cl2或(C14N)2Cl2,得到其CD谱,并用仪器附带的杨氏法计算出二级结构相对含量.2结果与讨论2.1级结构相对含量图1a,1b分别是不同浓度的(C12N)2Cl2,(C14N)2Cl2与2µmol·L-1HSA结合后由圆二色谱仪测得的CD谱,表1则是计算出的二级结构相对含量.(C12N)2Cl2,(C14N)2-Cl2在190~250nm的波长范围内没出现任何CD信号,这表明观察到的CD信号是由蛋白本身引起的.从表1可以看出,表面活性剂与蛋白质的结合作用会使蛋白质的二级结构发生变化,主要是α-螺旋向β-折叠的转变,这样会使构成α-螺旋的肽段伸展开来,转化为较为松散的二级结构,预测此过程应为焓变和熵变均增大的过程.2.2表面活性剂与hsa的结合力学2.2.1等温滴定量热dsc对于蛋白质和表面活性剂之间的结合反应,其基本假设为一个蛋白质分子具有两类结合位点,它们可结合相同的配体,并且同一类中的所有位点相同.此外,假定这两类位点相互独立,从而每一类位点上蛋白质与其配体的结合率彼此互不依赖.基于以上假定和Langmuir结合理论可得出:式中Ni(i=1或2)是第i类位点的结合位点数,θi是第i类位点的结合率,Ki是第i类位点的结合常数,cL,0和cP,0分别为配体L和蛋白质P的初始浓度,cL是配体L的游离浓度.将Eq.(1)代入Eq.(2)得:Eq.(3)是关于cL的一元三次方程,将其变形为:其中Eq.(4)有物理意义的根为其中ITC实验中第j次注射所得到的热量可表示为式中Vcell是微量热计中安瓿的体积,∆θi是从第j-1次注射到第j次注射第i类结合位点的结合率,∆Hi(i=1或2)是第i类位点的结合焓.由Eqs.(3)~(9)可知在cL,0和cP,0已知的情况下,cL是关于Ni和Ki的函数,所以Eq.(10)共含有K1,K2,∆H1,∆H2,1N和N26个未知量,由等温滴定量热数据利用MATLAB6.1软件以Qj对cL,0进行非线性最小方差拟合,即可获得上述六个热力学参数.2.2.2活性物质的结合位点模型见表2图2a,图3a分别是记录得到的298.15K时(C12N)2Cl2,(C14N)2Cl2与HSA结合的ITC曲线,图2b,图3b分别表示由实测ITC曲线积分得到的结合反应热对(C12N)2Cl2,(C14N)2Cl2)与蛋白物质的量之比的非线性拟合曲线.由图可见,这两种表面活性剂与HSA的结合均由最初的吸热反应转化为放热反应(转化时表面活性剂对HSA的物质的量之比(C12N)2Cl2约为24∶1,(C14N)2Cl2约为42∶1),这与文献中关于阳离子表面活性剂(DTAB)与牛血清白蛋白(BSA)结合的ITC曲线中所得能量转化趋势基本一致.由图2b和图3b中的曲线拟合程度可以看出,用两类结合位点模型可精确地模拟本文双子表面活性剂与HSA的结合,这两类结合位点分别对应:(1)表面活性剂带正电荷的极性基团与蛋白分子表面的氨基酸残基的静电相互作用,(2)表面活性剂的憎水基团与蛋白分子疏水空腔的疏水相互作用由表2数据可见,两类结合位点分别为强结合位点(高的K值)和弱结合位点(低的K值),且对应(C14N)2Cl2的相应K值均比(C12N)2Cl2有所增加,这表明(C14N)2Cl2与HSA的结合力比(C12N)2Cl2与HSA的结合力增强.值得注意的是,(C14N)2Cl2与HSA结合的弱结合位点数(4.5)远远小于(C12N)2Cl2与HSA结合的弱结合位点数(49.4),这很可能是尽管表面活性剂的疏水链较长时可以自卷曲,但由于HSA的疏水性空腔容积有限,而(C14N)2Cl2的疏水链过长,因此只有部分进入疏水空腔内,从而导致弱结合平衡位点数的明显减小.同样由于这个原因,使(C14N)2Cl2的极性基团与蛋白分子表面氨基酸残基的结合几率增大,导致其强结合位点数比(C12N)2Cl2有所增加.2.2.3探索c4d-l-2c2的实验结果由表2数据可见,强结合位点的焓变∆H1均为正值且对应(C14N)2Cl2的∆H1比(C12N)2Cl2更正;而弱结合位点的焓变∆H2均为负值,且对应(C14N)2Cl2的∆H2比(C12N)2-Cl2负值减小.这是由憎水相互作用,水分子由疏水空腔向本体相的转移,表面活性剂憎水链周围“冰山结构”的破坏及静电相互作用等因素共同决定的.(C12N)2Cl2与(C14N)2Cl2在样品池中的浓度变化范围分别为1.6×10-4~3.2×10-3和7.9×10-5~1.6×10-3mol·L-1,因此除前几滴外,两种表面活性剂在样品池中的浓度均超过各自的临界胶束浓度[(C12N)2Cl2:约7.8×10-4mol·L-1;(C14N)2Cl2:约1.4×10-4mol·L-1].所以,(CnN)2Cl2与HSA的作用涉及以下过程:(a)表面活性剂的解胶束;(b)表面活性剂胶束的稀释;(c)HSA与单分子表面活性剂的作用;(d)HSA与表面活性剂胶束的作用;(e)HSA二级结构的变化.首先,由于在ITC实验中进行了(CnN)2Cl2溶液向缓冲溶液中滴定的实验,(a)和(b)过程中的热效应在数据处理过程中均已被扣除.其次,在滴定过程中样品池中的表面活性剂浓度大多数已超过各自的临界胶束浓度,(c)过程的热效应也可以忽略不计.因此热效应主要是由于蛋白质与表面活性剂胶束的作用及蛋白质结构改变引起的.人血清白蛋白的等电点为4.7,所以在pH=7.0条件下,该蛋白分子表面带负电,表面活性剂带正电荷的极性基团与其相互作用应为放热过程,但双子表面活性剂带正电荷的极性基团与蛋白分子表面的氨基酸残基作用时,极性基团与蛋白分子表面的水化层结构均要遭到一定程度的破坏,此为吸热过程.并且从上述CD数据分析出蛋白质二级结构会发生变化,这也是吸热过程.从第一类结合位点的焓变为正值可知,水化层结构的破坏及蛋白质二级结构变化所需热量超过静电吸引作用的放热量.由于(C14N)2Cl2的强结合位点数稍多,蛋白分子表面的水化层结构破坏程度要大些,所以对应(C14N)2Cl2的∆H1比(C12N)2Cl2更正.弱结合位点主要是由于表面活性剂的疏水链与蛋白分子疏水空腔的疏水相互作用,当双子表面活性剂的疏水链进入蛋白分子疏水空腔时,必与空腔内表面发生疏水相互作用导致放出热量;同时,蛋白分子疏水空腔内的水分子被逐出到本体水相,该过程放出少量热量,这就使放热现象更明显些.但同时原来围绕在表面活性剂的疏水链周围的“冰山结构”必被破坏,这是一个吸热过程.从弱结合位点的∆H2均为负值可知,疏水作用是弱结合位点的主要推动力.同时由于(C14N)2Cl2的疏水链过长,只有部分进入疏水空腔内,导致与疏水空腔内表面的疏水作用及“高能水”释放所引起的放热量均减小,这应是对应(C14N)2Cl2的∆H2比(C12N)2Cl2负值减小的原因.2.2.4弱结合位点的熵变通过热力学公式∆G=∆H-T∆S和∆G=-RTlnK可求出结合过程的吉布斯自由能变化和熵变(结果见表2).所求得的∆G皆为绝对值较大的负值,表明所有的结合过程在本实验条件下都是自发的.所有结合位点的熵变皆为正值.熵效应的这种变化是与主、客体的微观结构和所处微观环境密切相关的.强结合位点相应的熵变主要是由于表面活性剂的极性基团和蛋白分子表面水化层结构的破坏,以及蛋白质二级结构的变化.弱结合位点的熵变则主要有以下原因:首先,由于憎水链插入蛋白分子的疏水空腔内部,空腔内水分子被驱赶回本体水相.再者,随着憎水链被疏水空腔包结,原来在其周围的水分子形成的“冰山结构”崩溃,也会引起体系的熵变增大.(C14N)2Cl2的疏水链过长,只有少部分进入疏水空腔内,因此若只考虑上述两种影响因素,对应(C14N)2Cl2的∆S2应小于(C12N)2Cl2.但是,(C12N)2Cl2与蛋白的疏水空腔尺寸匹配,疏水空腔和(C12N)2Cl2之间的憎水作用使表面活性剂胶束的运动自由度大大减小从而对应(C12N)2Cl2的∆S2减小.并且由于(C14N)2Cl2的疏水链有部分仍在疏水空腔外,具有较大的运动自由度,对应(C14N)2Cl2的∆S2增大,正是上述多种弱相互作用的协同效应导致对应(C14N)2Cl2的∆S2(91.99J·mol-1·K-1)比(C12N)2Cl2(29.10J·mol-1·K-1)大出许多.3强结合位点298.15K下,滴定式微量热法对HSA与两种季铵盐双子表面活性剂[(CnN)2Cl2,n=12,14]相互作用的研究表明,HSA对这两种表面活性剂有两类结合位点,一类是表面活性剂的极性基团和蛋白表面的氨基酸残基之间的静电作用造成的强结合位点(有较高的结合常数),此类结合为吸热过程;另一类是表面活性剂的憎水基团与蛋白质疏水空腔的疏水相互作用造成的弱结合位点(有较低的